精浆酸性磷酸酶和γ-GT的检测

精浆中含有较高的酸性磷酸酶和γ-GT活性,前者比血清高数十万倍,后者是血清的200~500倍。它们均由前列腺分泌,故精浆酸性磷酸酶和γ-GT活性均可反映前列腺功能。而且,由于两者的检测方法有一定可比性,故本节将两者放在一起叙述。

临床意义:精浆酸性磷酸酶活性高低可以反映前列腺的分泌功能。前列腺炎时精浆酸性磷酸酶活性降低;前列腺癌时精浆酸性磷酸酶活性升高。精浆γ-GT活性与酸性磷酸酶活性一样,可以反映前列腺的分泌功能。

精浆酸性磷酸酶的检测

一、检测原理

精浆酸性磷酸酶所用检测方法为磷酸苯二钠法。即精浆酸性磷酸酶在酸性条件下分解磷酸苯二钠产生游离酚和磷酸,酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用,经铁氰化钾氧化成红色醌的衍生物,根据红色深浅测出酶活力的高低。WHO推荐的方法使用的是相同原理,只是底物稍有不同,磷酸苯二钠法的底物为磷酸苯二钠,而WHO推荐的方法所用底物为p-硝基酚磷酸二钠。

二、所用试剂

  1. 0.2mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH4.9):枸橼酸钠(C6H8O7•H2O)42g,溶于600ml水中,用NaOH矫正pH值至4.9,加蒸馏水至1L。加氯仿数滴,冰箱保存。
  2. 0.01mol/L磷酸苯二钠基质液:取无水磷酸苯二钠2.18g(如含2分子结晶水应加2.54g),加蒸馏水至1L。此溶液应迅速煮沸,以消灭微生物,冷却后加氯仿4ml防腐,冰箱保存(一次不宜配过多)。
  3. 碱性溶液:碳酸氢钠4.2g,4-氨基安替比林0.1g,溶于100ml蒸馏水中,加入0.5mol/L NaOH 100ml,混匀。
  4. 铁氰化钾溶液:分别称取铁氰化钾2.5g,硼酸17g,各溶于400ml蒸馏水中,二液混合,加水至1L,棕色瓶暗处保存。⑤酚标准贮存液(1mg/ml):称取酚(AR)1g于0.1mol/L HCl中,用0.1mol/L HCl稀释到1L。

三、操作步骤

  1. 标准曲线的制备:按下表操作,加完试剂后,立即充分混匀,用510nm波长、0号管调零,读取吸光度值,以1~5管所得读数与其相应的酸性磷酸酶单位(依次为100、200、300、400、500U)回归绘制标准曲线。
  2. 将精浆用等渗盐水稀释1000倍后按下表操作。加完试剂后混匀,于510nm波长、蒸馏水调零后读取吸光度。
  3. 结果计算:以测定管吸光度-对照管吸光度之差值,查标准曲线求酶活力。1单位酸性磷酸酶定义为每毫升精浆在37℃水浴箱中与基质作用15min,产生10mg酚。

 酸性磷酸酶标准曲线建立步骤

酸性磷酸酶标准曲线建立步骤

酸性磷酸酶操作步骤

酸性磷酸酶操作步骤

四、正常参考值

正常生育男性精浆酸性磷酸酶活性为48.8~208.6U/ml。

精浆γ-GT的检测

一、检测原理

精浆γ-GT可分解γ-谷氨酰-α-萘酚为游离的α-萘酚,α-萘酚与重氮试剂作用产生红色物质,其色泽深浅与酶活性成正比。

二、所用试剂

  1. 硼酸盐缓冲液(pH9.0):硼酸钠3.092g、氯化钾3.728g,溶于500ml蒸馏水中,加1mol/L NaOH 21.4ml,加水至1L。
  2. 基质缓冲液(10μmol/L):取γ-谷氨酰-α-萘酚27.1mg,加pH9.0硼酸缓冲液10ml,加热助溶,注意加热时间不要过长。溶解后即置冷水中冷却,防止基质分解,冰箱保存,可用2周。
  3. 重氮试剂:临用时取甲液96ml加乙液4ml混合。甲液:氨基苯磺酸2g,溶于400ml水中加热,冷却后加冰乙酸200ml,再加水稀释至1L。乙液:亚硝酸钠0.1g溶于100ml水中,约可用1周。
  4. α-萘胺标准液(2μmol/L):取α-萘胺143mg,溶于无水乙醇10ml中,加水至500ml,临用前配制。

三、操作步骤

基本操作步骤为:①γ-GT标准曲线的制备:取α-萘胺标准液(2μmol/L)以蒸馏水稀释成每毫升含0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5μmol的标准液,按下表分别加入管中,每管0.25ml。试剂加完后,混匀,10min后,用520nm波长以0管调零读取吸光度值,与其相应的γ-GT单位(依次为25,50,100,150,200,250U)绘制标准曲线。②精浆用生理盐水稀释10倍后按下表操作。试剂加完后,混匀,10min后,于520nm波长用蒸馏水调零读取吸光度值。③结果计算:以测定管吸光度值-空白管吸光度值的差值查标准曲线,即可得γ-GT活力。1Uγ-GT定义为每毫升精浆在37℃水浴箱中与基质作用30min,释出α-萘胺0.5μmol。

 γ-GT标准曲线的制备

γ-GT标准曲线的制备

 精浆γ-GT检测程序

 精浆γ-GT检测程序

 

四、正常参考值

正常生育男性精浆γ-GT活性为69.3~206.5U/ml。

方法学评价

精浆酸性磷酸酶和γ-GT检测目前临床上仍以手工检测为主,每次检测时均需制备标准曲线,操作相对比较繁琐。两者相比,精浆γ-GT的稀释倍数远低于酸性磷酸酶,故检测误差比酸性磷酸酶检测为低,准确性相对高些。随着自动化检测的普及,精浆酸性磷酸酶和γ-GT的检测目前也正在从手工向全自动检测方向发展。

为了保证酸性磷酸酶和γ-GT检测结果的准确可靠,需注意四点:①每次检测时均需制备标准曲线,因为不同批次分析时,样本制备、吸样、孵育、比色等条件不可能完全相同。②精浆稀释后需立即检测,而且,由于标本稀释倍数较大,应确保充分混匀。随着精浆稀释后放置时间的延长,ACP和γ-GT活性均有所降低,这可能与ACP和γ-GT因稀释失去了精浆的保护作用有关。③离心速度不得低于3000g离心15min,因为过低的离心速度和时间会导致精液中精子和非精子细胞成分沉淀不完全,可能会干扰检测结果。④精浆酸性磷酸酶和γ-GT测定中应引入质量控制体系,对每批标本的测试都应该带有高、低浓度的两种室内质控品,可以用混合的冻融精浆标本作为质控品。

另外,除标准曲线法检测精浆酸性磷酸酶和γ-GT活性外,试剂盒法亦可检测精浆酸性磷酸酶和γ-GT活性,这是利用检测血清酸性磷酸酶和γ-GT试剂盒的方法加以改进而成的。检测精浆酸性磷酸酶时,首先将精浆标本作1∶10 000稀释,即5μl精浆加入495μl生理盐水,充分混匀后再吸取5μl加入495μl生理盐水,再次充分混匀后,取50μl稀释精浆按试剂盒说明书进行。ACP活性(U/ml)=测定管吸光度/标准管吸光度×10,其定义为:1ml精浆与基质在37℃条件下作用30min产生100mg酚为1个活力单位。检测精浆γ-GT活性时,取5μl精浆,加入到995μl生理盐水中,充分混匀后吸取50μl加至0.5ml底物基质液中,37℃水浴15min,加显色剂5ml,混匀后静置5min,在530nm波长处测定A值。精浆中γ-GT活力(U/ml)=(测定管A值-空白管A值)/(标准管A值-空白管A值)×30,其定义为:1ml精浆与基质在37℃作用15min释放出1μmolα-萘胺为1个单位。

由于试剂盒法的每次检测中均带有标准品,标准品可以和常规标本同时检测,并且可根据标准品的吸光度直接求出样本的酸性磷酸酶和γ-GT活性值,从而避免了标准曲线法查得酸性磷酸酶和γ-GT活性所带来的不足。而标准曲线不可能在每次检测时都制备,而往往是发现检测结果差异较大或者是更换试剂时才重新制备,这常常需经历相当一段时间。然而,在这一段时期内的每次检测过程中,由于样本制备、吸样、孵育、比色等条件的不同,每次检测的吸光度并不能真正代表所测得的精浆酸性磷酸酶和γ-GT活性。因此,试剂盒法略优于标准曲线法。

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