精液中的抗原:精浆抗原、精子抗原

抗原的基本性质具有异物性、大分子性和特异性。异物性是指进入机体组织内的抗原物质,必须与该机体组织细胞的成分不相同。自体内的某些隔绝成分也可以成为抗原,如精子、甲状腺球蛋白等,在正常情况下,这些成分通过机体的生理屏障与产生抗体的细胞相隔绝,因此不会引起自体产生抗体。但当受到外伤或感染,这些成分进入血液时,就像异物一样也能引起自体产生抗体,这些对自体具有抗原性的物质称为自身抗原,本章所述的精子抗原与精浆抗原就属于自身抗原。大分子性是指构成抗原的物质通常是相对分子质量大于10 000的大分子物质,相对分子质量越大,抗原性越强。绝大多数蛋白质都是很好的抗原。精子和精浆均含有大量的蛋白质,这是精浆和精子抗原性的分子生物学基础。大分子物质能够较长时间停留在机体内,有足够的时间和免疫细胞(主要是巨噬细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞)接触,引起免疫细胞做出反应。

如果外来物质是小分子物质,将很快被机体排出体外,没有机会与免疫细胞接触,如大分子蛋白质经水解后成为小分子物质,就失去了抗原性。特异性是指一种抗原只能与相应的抗体或效应T细胞发生特异性结合。抗原的特异性是由分子表面的特定化学基团所决定的,这些化学基团称为抗原决定簇。抗原以抗原决定簇与相应淋巴细胞的抗原受体结合而激活淋巴细胞引起免疫应答。换言之,淋巴细胞表面的抗原识别受体通过识别抗原决定簇而区分“自身”与“异己”。抗原也是以抗原决定簇与相应抗体特异性结合而发生反应的。因此,抗原决定簇是免疫应答和免疫反应具有特异性的物质基础。下面简要介绍精液中的抗原。

精浆抗原

目前已知精浆含有数十种抗原,其中大多数可以在血清中测出,如前白蛋白、白蛋白、α球蛋白、γ球蛋白、转铁蛋白、非特异性脂酶A和B、前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen,PSA)等。另外,乳铁蛋白、PAS阳性蛋白、亮氨酸氨肽酶、蛋白水解酶、碱性磷酸酶、透明质酸酶、顶体蛋白酶、LDHX以及蛋白水解酶抑制剂等均有抗原性,这些抗原可能来源于生殖道腺体分泌物。这些抗原中,有些与其他组织发生交叉,如乳铁蛋白和PAS阳性蛋白与乳汁交叉,亮氨酸氨肽酶与肾组织交叉。此外,也存在ABO血型抗原和HLA抗原,其存在的意义尚不清,与自身致敏无关。精浆中的抗原物质多为自体分泌或旁分泌,很少发生强烈的排斥性免疫反应,一般对男性生殖不产生影响。

精子抗原

20世纪初,Meichnikoff(1900年)、Pffeiffer(1905年)和Henle(1928年)分别发现精子具有抗原性。由于精子抗原结构上的多形性,功能上的复杂性,加之缺乏有效的分离和纯化手段,精子抗原的研究一直进展缓慢。近20余年来,随着杂交瘤技术、免疫印迹技术以及DNA重组技术等分子生物学技术的发展,人们对精子抗原的认识有了显著的提高。有些抗原是物种进化中保留下来的,可与多种哺乳动物精子交叉反应,有些有高度的种属特异性。精子抗原种类繁多,到目前已涉及100多种。按其来源特异性分为精子特异抗原和精子非特异抗原。按其与生育力的关系分为生育相关精子抗原和生育非相关精子抗原。按其部位分为包被抗原、膜固有抗原、胞质抗原和核抗原。近几年,许多与受精和早期胚胎发育有关的精子抗原受到特别关注。

特异性精子抗原

(1)受精抗原-1(fertilization antigen-1,FA-1):FA-1是一种精子膜糖蛋白,其单体相对分子质量为23 000,二聚体相对分子质量为49 000±2 000,二聚体间结合键是离子键而非二硫键。主要定位于顶体后区,其次为中段及尾部。用FA-1接种雌兔,绝大多数生育力完全阻断,血清中出现抗体。FA-1的单克隆抗体(简称为单抗)抑制鼠体外受精(IVF)及精子穿透去透明带仓鼠卵试验(SPA)。其单抗或多抗抑制哺乳动物受精,但不引起精子凝集及制动。可使预先致敏的小鼠淋巴细胞活化,分泌可溶性物质,激活巨噬细胞,显著抑制精子运动及胚胎发育;FA-1使免疫性不育患者的外周血淋巴细胞增殖。这表明可引起特异性体液免疫和细胞免疫反应,并通过此机制损伤精子及胚胎。FA-1可与不育男女及输精管切除患者血清反应,不与生育者的血清反应。其抗体的出现与IVF失败呈明显正相关。配偶的血清或男性精浆中有抗体均可阻断受精。免疫性不育患者血清经吸收后,可消除其对SPA的抑制,精子穿卵率明显增加。FA-1无蛋白水解酶/顶体素活性,抗FA-1可抑制人精子与透明带相互作用。免疫亲和色谱纯化的单抗在溶液中(不是在透明带表面)抑制人顶体反应,也抑制人精子与去透明带卵的融合,说明FA-1除参与精子透明带相互作用外,也参与精子获能及顶体排粒反应。调查表明,抗精子抗体(antisperm antibody,AsAb)阳性的不孕妇女宫颈黏液及血清中有IgG及IgA类抗体,阳性率为50%~80%。正常生育的妇女血清中71%(17/24)有抗独特型抗体(Ab2),而免疫性不孕妇女的这一比例仅为13%(3/23),且滴度低,处女则无此种Ab2。说明体内有针对和/或其他精子抗原的免疫网络存在。种属间有交叉反应,如人、鼠、兔等。[!--empirenews.page--]

(2)受精抗原-2(fertilization antigen-2,FA-2):FA-2亦为精子膜抗原,人精子FA-2的相对分子质量为95 000,尚有少量相对分子质量为61 000及28 000的FA-2。后两者可能是95 000经蛋白酶降解而成。主要定位于活的(特别是获能的)精子顶体区域,也可同时出现在赤道区。其单抗呈浓度依赖性抑制人精子穿卵,也显著抑制精子获能及顶体反应,不影响活动精子的百分率,但影响精子运动特征,如增加精子运动直线性,减少头部侧摆幅度及尾鞭打频率。FA-2的确切作用尚需进一步研究,与其他95 000膜蛋白的关系(如精子膜上与ZP3结合作为酪氨酸激酶底物起细胞信号转导作用的95 000蛋白质)尚需进一步阐明。哺乳动物种属间有广泛的交叉反应。

(3)卵裂信号-1(cleavage signal-1,CS-1):CS-1是一对相对分子质量约14 000及18 000蛋白质组成的偶合抗原(double antigen)。定位在精子膜上。其多克隆抗体可抑制受精卵第一次分裂,不影响精子穿卵及精(卵)原核形成。重组CS-1为33 000,成熟精子上的相对分子质量为14 000和18 000的CS-1可能是生精过程中由33 000裂解而来。推测的作用机制是:CS-1由精子带入卵子,作为卵裂的初始信号,或作为激活精子所必需的离子通道,促使初始卵裂。经检测,免疫性不育患者血清中有抗CS-1抗体。现正在研究微注射重组CS-1对卵母细胞卵裂的影响以及CS-1在免疫不育治疗上的应用价值。哺乳动物种属间有广泛的交叉反应。

(4)未知抗原(unknow antigen,AgX):Goldberg等用不育患者血清中的AsAb作为免疫探针,自睾丸λgtll cDNA文库中筛选出了一个阳性克隆,其表达产物命名为AgX。应用AgX cDNA作为探针,Northern Blot分析显示睾丸组织总RNA中含有大小为2.3kb的mRNA带,证明睾丸内有AgX基因的表达,用基因表达的AgX抗原免疫兔制得抗血清,并用AgX抗原亲和层析提取抗AgX抗体,Western Blot分析,用抗AgX抗体识别睾丸和精子的提取物,各有两条识别带,其中56 000为睾丸和精子特有,用荧光标记的抗AgX抗体进行定位研究,确定AgX抗原位于精子尾部的主段和颈段。由于Goldberg用能导致不育的AsAb筛选睾丸cDNA文库,其阳性克隆的表达产物为受精抗原的可能性极大,该抗原的相关抗体可通过抑制精子功能而降低生育力。

(5)精子/滋养层交叉反应抗原(sperm/trophoblast cross-reacting antigen,STX-10):为定位于人精子顶体内及人胎盘绒毛上的关联抗原(cognate antigen),天然状态下以聚合物形式存在。用其单抗从人胎盘提取的STX-10,主要是一组亚单位为75 000±5 000的糖蛋白,人精子提取物还包括一组相对分子质量小于20 000的三种蛋白质的亚单位。STX-10的免疫活性易被蛋白水解酶和低pH破坏,不受过碘酸钠影响,说明其特异性位点是肽而非糖基。其单抗显著抑制人SPA。STX-10可能在受精及胚胎发育中起重要作用。

(6)兔精子膜自身抗原(rabbit sperm membrane autoantigens,RSA):RSA为非酶性凝集素样蛋白。纯化的RSA经SDS-PAGE分析显示有相对分子质量为14 000、16 000、17 000、18 000的4条区带,较易形成65 000~70 000聚合物。RSA定位于成熟精子顶体后部。各区带经醋酸纤维膜转印后都能与兔卵子透明带提取物(特别是87 000成分)起反应,并可被硫酸葡聚糖和岩藻糖素阻断。去卵丘的透明带完整的卵子用RSA封闭,可抑制精子黏附透明带。这说明RSA与透明带的糖基连接,起凝集素样作用,使精子和卵子结合。其单抗或多抗在体内外均抑制受精,并抑制人SPA。现在尚不知免疫性不育患者血清中是否有RSA抗体。种属间存在有限的交叉反应,如与人、小鼠等。

(7)鼠精子抗原-63(mouse sperm antigen-63,MSA-63):单抗HS-63可以与人和多种哺乳动物的精子顶体发生反应,并有效地阻碍受精发生。HS-63所识别的鼠精子顶体抗原为MSA-63。用TritonX-100自鼠睾丸提取纯化的MSA-63,天然状态下其相对分子质量范围广泛,主要相对分子质量为200 000~300 000。二维凝胶电泳显示其亚单位相对分子质量范围在20 000~84 000,等电点为4.0~6.0,约分为5组。对各组分氨基酸测序,有3组类似于鼠肌动蛋白,1组类似于SP-10蛋白。SDS-PAGE显示其相对分子质量为24 000~50 000。从其cDNA序列推导的蛋白质相对分子质量则为27 900。据推测,MSA-63 与SP-10可能是不同结构基因共同表达到顶体上的同种异构蛋白(iso-proteins)。而MSA-63的多态性,可能是一个单基因产物翻译后修饰(包括糖基化、蛋白酶消化、与肌动蛋白紧密的共价结合)造成的。此抗原定位于获能精子的顶体,顶体反应后脱落。用能与人及鼠顶体结合的MSA-63单抗或抗血清可抑制鼠IVF及人精子SPA。免疫性不育患者血清中尚未发现MSA-63抗体。种属间有广泛的交叉反应。[!--empirenews.page--]

(8)鼠-29抗原(mouse-29antigen,M-29):免疫印迹显示M-29为一多肽,亚单位相对分子质量为60 000,易被蛋白水解酶分解成40 000。定位于精子赤道部。其单抗在体内外均浓度依赖性抑制受精,其作用部位可能在卵质膜,与精卵融合有关。种属间有交叉反应。

(9)PH-20:豚鼠PH-20的相对分子质量为64 000,定位于精子胞质膜上,顶体反应后出现于顶体内膜上。PH-20对精卵结合有重要作用。在体外,抗PH-20血清抑制豚鼠精子与透明带结合。用PH-20免疫或用其抗血清注射均可得到100%的抗生育效果,作用持久但可逆。种属间存在有限的交叉反应(如人与豚鼠)。Gmachl等用单抗从人睾丸cDNA文库中获取人PH-20,发现其有透明质酸酶活性。Lin等发现用基因重组技术得到的重组PH-20,可完全解离围绕在鼠卵细胞周围的卵丘细胞;与抗PH-20共育的顶体完整的精子,不能穿透卵丘层到达透明带,进一步提示PH-20有透明质酸酶活性。但免疫性不育患者的血清中似乎没有抗PH-20抗体。

(10)PH-30:是一种精子膜糖蛋白,具有细胞膜的外胞质融合作用。豚鼠实验表明,PH-30定位于成熟精子头后部,相对分子质量约为75 000,由两个抗原性不同的亚单位非共价键紧密连接而成。纯化的PH-30经非还原SDS-PAGE分为α(45 000)、β(25 000~28 000)两个区带,即两个亚单位,后者又可细分为β1、β2、β3。两个亚单位各自有较大的前体,在精子发育过程中不断加工,到附睾后加工成的α、β亚单位聚合成有受精作用的PH-30。用单抗研究表明,与受精有关的位点在β亚单位上。PH-30多抗或β亚单位单抗不抑制精卵连接,但显著抑制两者膜的融合。

(11)胚细胞抗原-1(germ cell antigen-1,GA-1):GA-1为精子膜蛋白。在非还原性SDS-PAGE中相对分子质量为63 000。其抗体不抑制精卵相互作用、顶体反应及精子运动,但影响受精后的胚胎发育。哺乳动物种属间有交叉反应。

(12)精子蛋白-10(sperm protein-10,SP-10):免疫印迹显示人SP-10为一种多态性免疫原性多肽,相对分子质量为18 000~34 000,个体间没有差异,不受还原剂影响,主要多肽抗原相对分子质量为29 000,等电点为4.9。他位于成熟精子顶体内,分布于顶体外膜内面及顶体内膜外面。人SP-10的cDNA序列显示其开放阅读框架由798个核苷酸组成,编码265个氨基酸,相对分子质量约为28 300。其单抗抑制精子穿卵。但目前尚未检测免疫性不育患者血清中是否含有其抗体,也不知用其主动免疫是否会引起生育力下降。种属间存在有限的交叉反应。人SP-10与其他灵长类(如狒狒、猕猴)及猪精子的SP-10有交叉反应,但与兔、牛、鼠、豚鼠、猫精子无交叉反应。

(13)糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白(glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins,GPI-APs):是一类通过其羧基末端的糖基化磷脂酰肌醇结构锚定于精子膜表面的蛋白,因其缺少跨膜区域,没有胞质尾区,特异地定位在质膜的胞外侧。大多数的GPI-APs是在睾丸的精子发生过程中插入的,GPI锚的添加发生在生殖细胞的糙面内质网的管腔中。就如一般的膜蛋白一样,GPI-APs鞘磷脂微区在高尔基体形成,并被包装成顶端运输小泡,以与一般膜蛋白相同的路径被转运到细胞表面。人类的PH-20蛋白就是以这种方式合成的。另外,许多GPI-APs可以在人类男性生殖管道管腔的上皮细胞合成,通过与膜囊泡(如附睾小体)的相互作用被转运到管腔分泌物中,然后再整合入精子膜上。CD55、CD59和P26h就是由附睾上皮以epididymosomes的形式分泌后整合入精子上的。GPI锚定蛋白同时参与精子的免疫保护过程,CD55/DAF是GPI锚定固体的补体调节蛋白,CD55在精液中大量存在,并可整合到精子上。雌性生殖道含有大量的补体成分,用来防御感染,但是同时对精子也会进行攻击,精液和精子上的CD55则对精子提供保护,使其免受补体的攻击。因此CD55对精子功能的发挥、精子在雌性生殖道的存活及过剩精子的消除中均发挥作用。CD73具有胞外5’-核苷酸酶活性,可催化AMP转化成腺苷,利于微环境中的腺苷在调节精子运动甚至顶体反应中具有重要作用。CD73已知的功能为:调节和增强精子的运动;在精子穿越生殖道的过程中,保护精子不受免疫攻击。因此,CD73或许不仅在正常的精子生理,而且在男性不育症的病理生理中发挥重要作用。CD52与CD59也具有免疫保护的功能,但是其功能更加多样,尤其是与男性生育的关系研究得较为深入。[!--empirenews.page--]

(14)YWK-Ⅱ相关抗原:YWK-Ⅱ是一种具有精子凝集作用的单抗,间接免疫荧光显示该单抗的相关抗原位于人精子中段、尾段和精子头赤道部的表面,而精子头赤道部是精卵结合部位,业已证明YWK-Ⅱ单抗可以阻断精子穿透去透明带仓鼠卵。目前已用YWK-Ⅱ作为探针,自大鼠睾丸cDNA文库中筛选出了表达该相关抗原的cDNA片段,约1.8kb,命名为RSD-2,原位杂交显示该抗原出现于精子发生的各个阶段,他的出现对生精细胞的分化有作用,目前已将该cDNA与质粒DNA重组,并在中国仓鼠卵细胞内得到表达。

(15)顶体素原结合蛋白:已经发现精子顶体内存在能和顶体素原结合的顶体素原结合蛋白,不同实验室提纯的结合蛋白大小较为接近,约28 000~32 000。SP-32是研究得较多的一种,已证明该蛋白存在于顶体内,相对分子质量为32 000,他能和顶体素原结合,明显促进顶体素原向顶体素转变。有人先提取出SP-32,用其免疫新西兰兔,制得抗SP-32抗体,并用该抗体作为免疫探针,自猪、豚鼠等睾丸cDNA文库中筛选出SP-32基因表达克隆,并证明SP-32仅能在睾丸内表达。其在生育中的作用正在研究中。

(16)钙结合蛋白(calcium-binding protein,calBp):钙离子对于精子运动和顶体反应均具有非常重要的作用,而钙离子的作用又依赖于calBp。有人自大鼠的生精细胞中提取出一种calBp,相对分子质量约为53 000。用该蛋白免疫兔制得抗calBp血清,用该抗体作为探针,筛选生精细胞的cDNA文库,获得阳性克隆。在粗线期生精细胞和圆形精子细胞均有相关mRNA的表达。calBp表达基因的获得为进一步研究该蛋白在睾丸内的表达及其对生精功能的影响等均具有重要意义。

(17)单抗S19、S69、S71、S72和S77分别识别的精子膜蛋白:应用S19、S69、S71、S72和S77这5种单抗对精子抗原进行定位观察,发现S19识别的抗原可能是精子表面与透明带结合的受体;S69定位的抗原是精子尾部纤维鞘抗原;S71和S72识别的是顶体抗原,其中S71识别顶体内、外膜抗原,S72识别的是顶体外膜上的某种蛋白;S77识别的是顶体外膜上的顶体抗原。这些单抗具有明显的抗生育作用。

非特异精子抗原

(1)肌酸磷酸激酶(creatine phosphokinase,CPK):相对分子质量为80 000,位于精子内,为能量转运关键酶,直接或间接参与精子成熟、精子与透明带结合、顶体排粒反应。精子CPK活性与精子浓度间呈负相关。不育男性精子CPK活性显著高于生育男性。

(2)甘露糖配体受体(mannose-ligand receptors,MLR):相对分子质量为48 000、61 000的糖蛋白,位于精子头表面,与精子获能、顶体反应状态显著相关,不育患者血清中无抗MLR抗体,各种AsAb影响MLR暴露的原因是增加精子膜非酯化胆固醇的含量,降低膜流动性。

(3)c-myc蛋白:相对分子质量为62 000及64 000,位于顶体区,其单抗抑制人精子SPA和鼠IVF,降低兔体内受精率,抑制精子运动。他可能参与精子获能或/和顶体反应。

(4)c-ras蛋白:相对分子质量为21 000,位于顶体区,其结构和功能与G蛋白极为相似。

(5)G蛋白:一组参与细胞膜信号转导的鸟苷酸结合调节蛋白,有大小G蛋白之分,有相似的结构和作用,参与精子生长、分化、顶体反应等。

(6)膜磷酸酪氨酸蛋白(membrane phosphotyrosine protein,MPP):相对分子质量为(94 000±3000)、(46 000±3000)及(25 000±7000)三组蛋白。其中前者可以结合人卵透明带或猪ZP3,为酪氨酸激酶底物,起信号传导作用,受精或接触透明带后自身磷酸化程度增加。其单抗显著抑制人精子接触和穿透去透明带仓鼠卵。

其他精子抗原

(1)顶体素(acrosin):又叫精子头粒蛋白,具有丝氨酸蛋白酶活性,能解离透明带。主动免疫动物如兔等,可使血清中出现其抗体,但不影响生育力。

(2)ABO血型抗原:非精子固有,为精浆成分包被于精子膜上,对免疫性不育似无意义。

(3)HLA抗原:HLA抗原是由位于人第6号染色体主要组织相容性复合物基因所编码的膜结合糖蛋白,已知有与生殖有关的免疫识别功能以及一些非免疫学作用。有报道显示在正常睾丸组织缺乏HLA-I类抗原表达。在体细胞和生殖细胞中,HLA-A、B、C和E位点呈甲基化状态,而在精子前体中,HLA-F和G基因甲基化程度较低。这与免疫耐受的维持有关。

(4)精核蛋白(protamine):为核抗原,其抗体不抑制精卵相互作用、顶体反应及精子运动,故与生育无关。[!--empirenews.page--]

(5)精子膜抗原(sperm-coating antigens,SCA):又称scafferrin,是一类包被于精子表面的抗原,来源于精囊等。有人用单抗从精浆中提取到相对分子质量为70 000、64 000、60 000三种蛋白质,可与不育患者血清反应;也有人在兔的精浆中发现了来自附睾的由相对分子质量为38 000和92 000亚单位组成的异二聚体,能使已经获能的精子去获能,并能防止顶体反应,据认为对防止贮藏于附睾内尚未成熟的精子提前获能有重要意义。

抗原相对分子质量的不同也可能与抗体的形成及种类密切相关,研究显示不育男性中AsAb结合的抗原带主要为55 000,而输精管切除术后的患者AsAb结合的抗原带主要为72 000。由此看来,对人精子抗原的鉴定有助于了解AsAb影响精子功能的机制。众所周知,抗原抗体反应是否发生中和效应取决于抗体结合的蛋白质的抗原决定簇。在Afatoonian等的研究中,所有男性研究对象的血清中均有针对精子的抗体。在大多数病例中,生育和不育男性的抗体明显针对同一精子抗原。这似乎可得出一种结论:生育和不育男性的AsAb的抗原特异性没有差异。然而,很有可能来自不育和生育男性的AsAb针对同一蛋白质,但这两组的抗体针对的可能是不同的抗原决定簇。例如,针对CD46的第一个具有短重复序列(SCR)结构域的抗体可降低精子与卵细胞的作用能力,而与CD46其他结构域作用的抗体则不能阻碍精子和卵母细胞的相互作用。

因此,对于针对同一蛋白质的抗体,在生育男性中可能产生无中和作用的抗体,反之,则可能产生有中和作用的抗体。Burden等研究显示针对表达于精子头部不同抗原的同型单克隆抗体,可阻碍精子黏附于透明带或精卵膜融合。此外,针对同一精子表面抗原的不同抗原决定簇的抗体,也可能以不同方式影响精子功能。从精子膜蛋白中分离出6种蛋白质:HSP70、HSP70-2、二硫化物异构酶ER60、惰性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶以及两种蛋白酶的亚单位(caspase-2和zymogen),对这些蛋白质进行生化鉴定可进一步了解AsAb影响精子功能和受精过程的机制。

精子抗原的种类和抗原决定簇的性质、数目和空间结构的多样性,决定不同的抗原诱导机体产生不同类型的抗体。主要组织相容性复合体(MHC)的多态性决定免疫应答的强弱,对特定个体而言,其所携带的MHC基因型由遗传决定,因此不同个体对同一抗原的反应不一,有些男性体内虽然存在AsAb,但这些抗体也许只针对生育影响较小的精子抗原,这部分人仍具生育能力。因此找出那些在生育过程中起重要作用的抗原,对免疫性不育的诊断和治疗将有所帮助。

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