精子获能的分子机制及离子通道扮演的作用

虽然获能这一现象在60年前就被发现,然而只是在近年来,发现了一些对于获能必要的成分,如:CO2、Ca2+、血清白蛋白等,才开始了对其分子变化及机制的了解。体外实验研究表明,没有这些物质的存在,精子就不能获能和使卵子受精,而且,这些物质相对浓度的变化在生理情况下也是存在的。这些物质的研究尽管表明了精子获能的一些变化及可能的机制,但其分子机制仍需要进一步的研究。目前,对于获能的分子机制主要是基于这些物质通过调控腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase,AC)/cAMP、精子膜的变化和蛋白磷酸化(下图),最终使精子获能。

 精子获能部分分子机制

精子获能部分分子机制

精子获能的分子机制

DF和DF受体(DF-R)

DF是一种糖蛋白,相对分子质量为40 000,这种糖蛋白对于加热和蛋白水解酶不敏感,这可能与糖基的存在有关。DF通过与DF-R结合起作用,DF-R是具有岩藻糖结合位点的膜GPI锚定受体。分离DF-R进行测序,表明与PEBP1(phosphatidylethanolamine-binding protein 1)高度同源,而重组表达的PEBP1具有类似DF-R的作用。用针对PEBP1的单克隆抗体对人精子进行免疫定位,表明在精子头部和尾部均存在。DF-R被认为是通过调节其他膜蛋白的功能状态来起作用的,包括多种G蛋白耦连受体(G-protein coupled receptor,GPCR)、Ca2+-ATPase等。前者进一步调节激活型或抑制型Gα亚单位(stimulatory Gαsubunit/inhibitory Gαsubunit,Gαs/Gαi),后者则直接影响精子胞内Ca2+浓度。

GPCR和Gαs/Gαi

在精子获能中起作用的GPCR包括腺苷、降钙素、肾上腺素及气味受体等,GPCR也是位于精子胞膜上,主要是通过结合这些物质后,通过Gαs/Gαi影响的功能状态而起作用。Gαs是精子获能中,刺激膜型腺苷酸环化酶(membrane associated adenylyl cyclase,mAC)所需要的亚单位,而Gαi则起抑制作用。诸多研究表明,Gαs/Gαi都存在于精子胞膜中。

精子胞膜的变化

精子胞膜的变化,包括通透性及流动性的增加,对于精子获能是很重要的环节。胆固醇含量减少,胆固醇/磷脂比率降低被认为能够增加膜通透性和流动性,尤其是精子顶体膜处胆固醇的流失是精子获能过程的关键步骤。其主要的意义可能在于:①通透性的增加使一些调控分子易于进入精子,如Ca2+和HCO-3的内流,可以通过调控AC而导致cAMP;②上述参与精子获能的很多受体和功能单位,如DF-R、GPCR、Gs/Gi等,都位于细胞膜内,精子胞膜的这些变化,也可能改变这些受体和功能单位的功能状态或活性。在体外获能实验中,白蛋白的主要作用被认为是胆固醇的受体,导致精子胞膜胆固醇的流失,而增加膜的流动性和通透性。在体内生理条件下,白蛋白也是输卵管分泌的一种主要蛋白,所以,这种机制在体内也应该存在。同时,白蛋白的这种作用还需要其他因素的存在或参与,如HCO-3。胆固醇的减少及膜流动性的改变还有其他的机制:在精子胞膜里存在甾醇类及硫酸酯,而雌性生殖道及卵泡内存在甾醇类结合蛋白和硫酸酯酶。当精子进入雌性生殖道后,雌性生殖道内的甾固醇结合蛋白能够去除一部分精子胞膜里的胆固醇;而硫酸酯酶则通过酶解精子极性脂质为非极性脂质,改变精子胞膜的硬度,使精子质膜局部脂质的流动性更易发生改变。

AC

AC有很多亚型,包括上述mAC和另外一种可溶型腺苷酸环化酶(soluble adenylyl cyclase,sAC)。sAC主要表达于睾丸组织中,在精子仅存在于尾部,主要定位于尾部中段和终环。mAC目前已发现有9种,而且大部分存在于多数的哺乳动物中。AC的激活及cAMP的产生是精子获能分子机制及调控的核心环节:cAMP可以激活一些重要的信号途径,包括目前在精子获能中认为很重要的PKA途径,PKA途径目前认为是精子获能中蛋白酪氨酸磷酸化的上游事件。cAMP的代谢是被磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)降解为5’AMP,所以PDE可能通过调节cAMP水平,而对精子功能产生影响,这在一些研究中得到证实。目前已知的PDE有11种,其中有一些,如PDE1、4、6、8、10、11等存在于哺乳动物精子中。

蛋白酪氨酸磷酸化

最早是在小鼠精子获能中发现了精子的蛋白酪氨酸磷酸化,后来,这种变化在其他哺乳动物中得到证实;1996年在人精子获能过程中也证实有蛋白的酪氨酸磷酸化。精子获能中这种变化被认为是依赖于cAMP激活的PKA途径,但这个途径中的具体分子事件还不明了。目前,也已经鉴定了一些在精子获能过程中发生酪氨酸磷酸化的蛋白,包括一些可能在糖酵解中起重要作用的蛋白。另外,精子膜蛋白酪氨酸磷酸化加剧,也是精子获能过程中发生的重要变化,它使精子膜胆固醇对磷脂的比率发生改变,即比率降低,从而使精子膜流动性增加及使一些精子膜受体暴露。研究认为,精子膜酪氨酸磷酸化增加可能主要涉及两种因素,一是由于获能过程中活性氧(ROS)的增加,使细胞的还原状态发生改变;另外,酪氨酸磷酸化增强也与cAMP有关。

离子通道在获能中的作用

在附睾的微环境中,离子种类和浓度与精浆及女性生殖道都有很大的不同,与其他体液相比,附睾液中Na+比较低,而K+和Cl-比较高,pH值也偏低,这种环境对于储存精子是必要的。精子射出后,在精浆中及女性生殖道内,K+降低,而Na+和HCO-3升高。这些环境中离子浓度的变化是精子获能分子机制的一个重要方面,因为离子通道的开启及离子浓度的变化速度很快,能激活多种信号途径,这对于翻译和转录都处于惰性状态的精子来说,在功能的完善及执行方面是至关重要的。离子浓度在精子获能过程中这些微环境的变化,也为精子体外受精的获能实验所需要的培养液及条件提供了重要的参考,目前,哺乳动物精子获能的培养液基本都含有与血浆浓度相近的Na+,K+,Ca2+,Cl-和HCO-3,再就是能量物质,如葡萄糖,丙酮酸,还有白蛋白。可能参与精子获能的离子通道几乎包括了目前在精子中发现的所有离子通道,如CatSper家族、Cav、NHE、ENac、Kir、Slo3、CFTR等,然而,在精子获能中研究较多的离子是Ca2+ 和HCO-3

Ca2+

Ca2+是调节精子获能重要的第二信使分子。当牛精子孵育在获能培养液内,精子胞内Ca2+浓度增加6倍,激活Ca2+依赖的三磷酸腺苷酶(ATPase)以及AC,进而激活相应的信号途径。相反去掉精子周围环境中的Ca2+则抑制精子获能,但不影响蛋白酪氨酸磷酸化的进行,提示Ca2+与蛋白酪氨酸磷酸化在精子获能中的调控机制不相同。与钙调蛋白结合激活多条细胞内信号途径,是Ca2+调节多种精子细胞功能的作用机制之一。在精子获能培养液内分别加入6种钙调蛋白抑制剂均可以抑制精子获能发生。其中有3种抑制剂可同时影响精子存活率和蛋白酪氨酸磷酸化,提示在精子获能过程中钙调蛋白激活了不同的下游信号途径,其中包括PKA相关的蛋白酪氨酸磷酸化途径。

HCO-3

在哺乳动物,HCO-3通过改变精子胞内pH值从而在精子获能过程中发挥重要作用。研究显示以NaCl替换培养液内的NaCHO3后精子胞内pH值下降,获能精子数量相应显著下降;用HEPES替代培养液内的NaCHO3可以阻断仓鼠精子获能发生。但是,HCO-3诱导获能的机制并不是单纯升高胞内pH值,因为单纯升高精子胞内pH值而不是用HCO-3,其诱导的精子获能率很低。HCO-3诱导精子获能的机制主要与sAC有关。获能时,HCO-3进入精子胞内,引起细胞内胆固醇外流和sAC活化,促进胞内cAMP合成,cAMP激活蛋白激酶(PKA)信号通路,增加胞内蛋白酪氨酸磷酸化程度,从而在获能中发挥作用。另外,PKA被激活后还能够促进精子顶体外膜上的电压依赖性Ca2+通道打开,激活磷脂酶C,促进磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)生成,PIP2作用于蛋白激酶C,引起精子质膜上电压依赖性Ca2+通道开放,再次升高胞内Ca2+,最后诱发质膜溶解和顶体反应发生等生物学效应。

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