影响精子获能的因素

哺乳类动物和人的受精部分均在输卵管的上端,几乎都是精子在输卵管等候卵子,而不是卵子等候精子。精子经过三个旅程进入雌性生殖管道后,并不立即受精,而需要停留一段时间,这就是张-奥斯汀原理——精子获能(sperm capacitation)。

关于灵长类和人的精子获能是否必需,目前尚缺乏明确的证据。最大的困难在于,研究精子获能期间动态观察没有直接指标,即尚未捕捉到精子在获能期间的形态变化的动态图像资料。目前所能观察到的是精子获能过程中发生了以下改变:①除去或改变了包被在精子表面的一些物质;②通过脂类交换或水解作用,改变了精子脂类成分;③促进了质膜蛋白水解;④质膜作为精子甾酮接受器以调节精子脂类水平。但这些变化无一例外的是离体的,且经处理后的精子活化情况。

综上所述,精子获能过程中包含以下几个重要环节(下图):①精子胞膜胆固醇流失,胆固醇/磷脂比率下降,胞膜脂质流动性和渗透性均增加。②HCO3-和Ca2+内流。前者激活精子胞内的sAC,促进cAMP合成,进而激活PKA,通过酪氨酸蛋白激酶和磷酸酪氨酸磷酸酶的双重调节而促进蛋白质酪氨酸磷酸化,最终引起获能。后者主要是通过Ca2+/钙调蛋白激活多条下游信号途径包括cAMP/PKA途径,从而在获能中发挥调节作用。③蛋白酪氨酸磷酸化。Ca2+、HCO-、FPP以及O-32等能够直接或间接促进cAMP/PKA途径,或通过抑制磷酸酪氨酸磷酸酶而促进蛋白质酪氨酸磷酸化以诱导获能。④精子超激活运动。获能时,胞外环境中的Ca2+主要通过精子胞膜上的CatSper进入体内,[Ca2+i升高,Ca2+结合钙调蛋白调节精子骨架蛋白活化,从而诱导获能相关的超激活运动发生。

 精子获能过程示意图

精子获能过程示意图

生物酶

根据精子获能方面的研究报道,在精子获能过程中,酶的调节是必不可少的。精子的获能部位主要在子宫。而宫颈管、子宫腔、输卵管液中含有丰富的水解糖蛋白的酶,如β-淀粉酶、唾液酸苷酶等的水解作用,使精子表面包裹的去能因子(decapacitation factor)被解脱,细胞膜暴露,激活受体部位,受精能力出现。

近几年来研究更多的是,精子在获能期间,膜离子通道,特别是钙通道被活化,耗氧量和糖酵解明显增强。腺苷酸环化酶和神经氨酸苷酶被激活,导致胞内cAMP含量升高,从而促进精子获能。透明质酸酶、顶体素、半乳糖苷转移酶和磷脂酶则参与了顶体反应。

一、透明质酸酶 顶体内含有水解蛋白酶和磷酸酯酶等达24种之多。其中以透明质酸酶(hyaluronidase)和顶体素(acrosin)与受精关系最为清楚。透明质酸酶主要分布于顶体前膜,重要的生物学作用是分解卵丘细胞的透明质酸,有助于精子的穿透。

二、顶体素(acrosin) 又名顶体蛋白,其化学性质类似于类胰蛋白酶能水解酰胺酶(amidase),既能水解酯酶的底物,又对不同底物的分解能力有差异。顶体素作为一种丝氨酸蛋白水解酶(serine protease),其分子结构由酶原功能域、催化功能域、尾部功能域三部分构成。前二者的氨基酸序列无种属差异。差异表现在尾部功能域,这说明尾部功能域在受精过程中起重要作用。顶体素位于精子顶体内层浆膜上,属膜结合型酶。活化的顶体素一方面溶解顶体膜基质成分,另一方面又作用于卵子的透明带。

三、半乳糖苷转移酶(galactoside transferase)通常是从尿苷二磷酸半乳糖(UDPGal)转移到N-乙酰半乳糖胺(GalNac)或游离N-乙酰半乳糖胺生成半乳糖-N-乙酰半乳糖胺而成。α-乳蛋白特异性结合半乳糖苷转移酶,通过提高Km值途径,抑制N-乙酰半乳糖胺的半乳糖苷化,同时又可通过降低Km值而增加葡萄糖的半乳糖化。因此,在α-乳蛋白的作用下,半乳糖苷转移酶合成的是乳糖,而不是合成N-乙酰氨基乳糖。实验结果表明,哺乳类动物精子表面有半乳糖苷转移酶受体存在。推测半乳糖苷转移酶至少是精子同透明带结合这一关键环节必不可少的主要成分之一。

四、磷脂酶(phosphatidase,phospholipase) 有三个酶解部位,即磷脂酶A2,磷脂酶C和磷脂酶D。

磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2)作用于磷脂第二个脂键。PLA2有两种,即依赖Ca2+的和不依赖Ca2+的PLA2。依赖于Ca2+的PLA2又分两类:胞浆型(cPLA2)及分泌型(sPLA2)。cPLA2活化位点是丝氨酸(GLSG)序列,有多个磷酸化位点。未被活化的cPLA2存在于胞浆,激活后与Ca2+结合并磷酸化,然后转移到膜与底物反应。对于sPLA2的结构目前还不太清楚,结构中有7个二硫键与活性有密切关系。不依赖Ca2+的IPLA2的作用是通过膜上的受体。PLA2受体已被提纯,分子量为90kDa,是一条多肽链,N端在细胞外,中间是膜内区,C端在胞内。

精子的脂类代谢活性以磷脂为最强。磷脂占脂类总量的60%。因此,磷脂的代谢正常与否关系到精子膜结构的完整性和功能状况。精子发生顶体反应的过程中,以磷脂酶A2的作用最为重要,这是因为顶体素激活磷脂酶,将精子膜上的磷脂分解为溶血磷脂和脂肪酸,这两种物质可促进膜发生融合。而游离脂肪酸可抑制细胞间的白蛋白吸收磷脂酶。

五、嗅环核酸酶 研究发现,嗅环核酸酶在精子细胞期表达,说明这种酶作为一种信号参与了精子形成生长的调节。

六、蛋白激酶 在精子获能过程中存在有蛋白磷酸化,而蛋白磷酸化是蛋白激酶(protein kinase,PK)将磷酸基团转移到特定底物蛋白上共价修饰完成的。其作用是调节蛋白质的酶学活性或生物学功能。

蛋白激酶分为两类:一类是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶;一类是酪氨酸蛋白激酶。经第二信使Ca2+、二酰甘油(DAG)或磷脂酰丝氨酸刺激后激活的蛋白激酶称为蛋白激酶C。PKC是肌醇磷脂信息转导通路的关键环节。人们对其与精子功能的关系了解得最多。

PKC为一类分子量在78~90kD的9种结构相关蛋白组成的同工酶族。现已知PKC的9种亚型分别为:α、βⅠ、βⅡ、γ、δ、ε、ζ、η、ι。每一亚型PKC编码基因在染色体上定位不同。根据保守氨基酸残基的分布,各亚基蛋白结构包括五个可变区(V1~V5),相嵌排列的四个保守区。PKC经Ca2+依赖蛋白酶限制性水解成N端和C端,C端催化区C3和C4含有ATP结合位点和引起磷酸转移酶激活的序列,而催化V4和V5决定底物的特异性。N端调节区V1具有自身抑制的假底物位点序列。C1区包括2个富含半胱氨酸的重复序列(Cys-X-Cys-X13(14)),它与金属蛋白或DNA结合蛋白Cys-Zn2+-DNA指状结合区的序列同源。C3区使α、β、γ亚型呈Ca2+依赖性,必须在Ca2+和磷脂作用下酶才得以被激活。相反,ε、δ、ζ、η和ι亚型因缺乏C2区,而表现出非依赖性激酶活性。

活化型激酶与锚定蛋白的相互作用决定PKC定位。PKC的锚定蛋白具有16个氨基酸残基的保守序列,代表PKC结合位点。PKC催化的特异性底物蛋白Ser/Thr残基磷酸化,底物分为四类:①受体蛋白;②收缩蛋白和细胞骨架蛋白;③膜蛋白和核蛋白;④酶和其他蛋白。

七、腺苷酸环化酶(adenylate cyclase,AC) 是催化生成cAMP的关键酶。哺乳类动物精子膜上含有与AC系统相偶联受体。不同激素与其相应受体结合后,引起AC激活或抑制。活化AC的受体为兴奋性受体(Rs),抑制AC的受体称为抑制性受体(Ri)。AC受体具有两个主要结构,即识别位点和G蛋白结合区。识别位点具有一个七次跨膜螺旋疏水区的同源结构,G蛋白结合区分别与Rs 或Ri结合,并通过不同的机制改变酶活性。

腺苷酸环化酶在cAMP信号转导中处于中心地位,并有自成体系。这一体系主要由以下四部分共同构成:①激素、神经递质及局部调制物等的受体(receptor);②鸟苷酸结合蛋白(G蛋白);③AC催化亚单位(C);④活化AC的协同子。这些组分通常以低浓度散在分布于细胞膜中,只有紧密联系在一起时才表现出活性,每一组分对于cAMP的合成均是必需的。

精子膜上分布有与AC系统偶联的受体。细胞外信号分子与膜受体发生结合,一方面改变了受体的带电性,另一方面引起受体构象改变,使受体在膜上发生移位,而且膜脂质甲基化后引起的脂质流动性增加等促进受体在膜上的移位和聚焦。随后,受体与G蛋白结合而触发信号转导过程。

八、蛋白质羧甲基化酶(protein carboxylmethylase,PCM)的作用由于形成蛋白质羧甲基化而造成负电荷的中和。精子尾部蛋白质羧甲基化酶含量最高。而且蛋白质羧甲基化酶的水平是随精子逐步成熟而呈线性增高。蛋白质羧甲基化酶缺乏患者的精子完全制动。

九、肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK) 是一类能催化肌球蛋白轻链发生磷酸化反应的蛋白激酶,其分子量范围从37~155kD。MLCK分子具有一个钙调素结合位点和一个具有激酶活性的催化区。不同种属分子结构有一定差异。哺乳类动物(包括人)精子膜有肌球蛋白轻链存在,而MLCK能专一地磷酸化肌球蛋白轻链。故此,推测与精子运动有关。但由于研究资料不多,故其详细的机制不太清楚,很可能与精子获得运动能力时的蛋白磷酸化有关。

十、磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE) 主要参与第二信使cAMP和cGMP的分解,至少有五种异构酶。3',5'-环核苷酸二酯酶使cAMP降解为5'-AMP。这种酶又被甲基嘌呤类所抑制。咖啡因是甲基黄嘌呤类化合物,它改善精子质量的作用机制是由于AC系统对于精子代谢的调节,以及在保持精子具有良好地运动方面都发挥着重要作用。低浓度的咖啡因可以通过抑制PDE的活性,使精子环式核苷酸,特别是cAMP升高,增进精子的氧化代谢和能量产生;稍高浓度的咖啡因可以影响Ca2+的跨膜转运,降低精子内Ca2+浓度,从而增强精子的活动力。在此值得说明的是,PDE协同剂或类似物对于有运动能力的精子有促进运动强度的作用,而对于不活动的精子则有启动精子尾部活动的作用,但不诱发精子前向运动。

十一、ATP酶 Mitchell的理论清楚的确定了由生物氧化过程驱动的离子跨膜梯度是生成ATP的能量基础。任何降低这一梯度的过程或因素,都可以认为是一个消耗ATP的系统。因而,作为离子泵的ATP酶实际上是所有细胞在启动或调节其重要活动过程中起重要作用。ATP酶可粗略地分为三类:即Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶和H+-ATP酶。

H+-ATP酶由位于水相的催化中心,嵌入膜脂双层的疏水部分,和连接二者的赋予寡霉素敏感蛋白等组成。

Na+-K+-ATP酶由两各个不相同,但都是疏水的亚单位α与β组成。两个亚单位由于紧密连接而可以看做是一对二聚体(α、β),这两个亚单位的分子量因不同组织来源而表现出差异,α亚单位分子量范围在(90~100)×103,而β亚单位在(45~55)×103。小分子量的亚单位是个糖蛋白,可能与酶分子在膜上的方向性有关。大分子量的亚单位或许就是催化亚单位,横贯整个膜的厚度。

所有离子泵ATP酶的特性是:它们都与膜紧密结合在一起;它们的功能都是把离子从一个细胞转移至另一间隙或从胞内转向胞外。阳离子是对抗着一个浓度梯度而被泵出来,这种反热力学的状态是由来自ATP裂解为ADP与无机磷所产生的能量驱动的。

不同种属精子,运动情况不同。对ATP酶活性的测定、ATP量的测定均无一例外地表现出相似性,即ATP酶活性与精子活力呈正相关关系。

十二、酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase,TPK) 活性系最早在src癌基因产物上观察到的,以后的研究发现,许多癌基因产物及一些生长因子的受体也具有TPK活性。当生长因子与其受体结合后,受体发生变构,TPK活性增强,使细胞内蛋白质的Tyr残基的磷酸化程度增加。

TPK的基因类型大体上可分为两类:一类是癌基因,如PP60srcPs85ps等。另一类为生长因子。TPK活化域存在很高的保守序列。其中的一个序列GlyXGlyXGly15-20Lys是ATP的结合部位,它对于ATP活性是必需的。

TPK对底物存在高度特异性。人们目前已知所有TPK底物都有一保守区,称为src同源区2(简称SH2区)。同源区(SH区)是在src相关的非受体酪氨酸激酶中发现一些高度保守区。其中SH1代表催化区,SH2和SH3代表调节区。SH2区含有约100个氨基酸。其中还有5个区是高度保守的,SH2区的功能是作为Tyr磷酸化蛋白的结合部位,负责信号转导机制中与Tyr磷酸化的受体结合这个环节。

TPK型受体有三型:Ⅰ型和Ⅲ型是由单一肽链构成的受体,肽链中只有一个α-螺旋跨膜区,跨膜区由22~26个疏水氨基酸构成。Ⅱ型由4条多肽链构成。受体的细胞外区较其他受体大得多,一般有500~600个氨基酸残基,由于配体是与膜外区结合,所以不同家族之间在这一区域的氨基酸组成差异较大。受体的胞内区又分为近膜部分和酪氨酸蛋白激酶部分,近膜部分由41~50个氨基酸组成,可能有信号修饰作用。激酶部分是受体具有酶活性的催化部分,高度保守。这一部分又分为ATP结合区和底物结合两个功能区。羧基末端的变化最大,含70~200个氨基酸,为非催化区,有修饰催化区的功能,这型受体按其分子结构,可分为三个受体超家族。

第Ⅰ族为单一肽链受体。受体细胞外区域有两个富含半胱氨酸序列重复区,两个区域之间没有二硫键,各自的区域内通过自身的二硫键折叠形成高度稳定的结构,胞内有一疏水区。

第Ⅱ族受体为4条多肽链(即两条α链,两条β链)。肽链之间由3对二硫键相联。两条α链各有一富含半胱氨酸的重复序列。α链没有跨膜区,β链各有一跨膜区和激酶区。α链和β链是同一编码基因的前体的裂解产物,各含一个亲水区。

第Ⅲ族受体也是单一肽链,它没有细胞外富含半胱氨酸的重复序列,细胞内的催化区由一亲水区(77~107个氨基酸)分成两部分。

对于精子而言,TPK催化蛋白质底物磷酸化,还可催化ATP转变为ADP,并为蛋白质提供磷酸基团。这种磷酸化反应改变了精子中蛋白质的功能,以利于传递信号,并可能为精子运动提供物质供需。

激素与信号分子

一、孕激素(progestogen)

能够促进精子获能。体外研究显示,精子获能液内加孕激素共孵育后显著提高精子顶体反应发生率。并且体外实验显示孕激素最佳孵育时间(5小时)和浓度(200ng/ ml)与体内精子获能时间和浓度(排卵前输卵管内孕激素水平约200ng/ml)相符合。在体内,当精子与冠-卵-丘复合物相遇,卵丘细胞分泌的孕激素促进精子获能,协同精子与卵子透明带结合,诱导顶体反应发生。因此,孕激素作为获能和顶体反应促进因子已被临床用于检测精子获能程度。孕激素促进精子获能和顶体反应的机制与通过γ-氨基丁酸受体介导的胞内Ca2+释放有关。

二、受精促进肽(fertilization promoting peptide,FPP)

是一种与促甲状腺素释放激素结构相似的三肽,由前列腺产生并释放到精浆内,与精子共孵育1小时后能促进小鼠精子获能,抑制自发的顶体反应,最大限度地增加到达精卵受精部位的精子数量。FPP作用机制尚未明确,有研究推测FPP通过与膜G蛋白耦合受体结合刺激膜结合腺苷酸环化酶,进而调控精子胞内cAMP水平来调节精子获能。

三、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)

能够刺激小鼠和人精子获能,其作用机制可能与EGF激活了精子膜上EGF受体的酪氨酸激酶信号转导途径有关。

四、cAMP

众所周知,cAMP信使系统是细胞一个极其重要的信号转导通路,在细胞外信号分子调节细胞功能的过程中,起着快速跨膜转导和放大信号的作用。cAMP的生物学效应主要是通过APK实现的,胞内信使cAMP产生以后,主要通过激活APK使靶蛋白磷酸化而传递信号。当cAMP信号终止后,靶蛋白的活性则在脱磷酸化作用下恢复原状。APK分子结构后述。APK与cAMP间反应公式如下:

从这一反应式可以看出,cAMP之所以能激活APK,主要由于cAMP对APK有去抑制作用,cAMP浓度的高低直接影响R cAMP的结合量,控制细胞内C亚基释放率和释放速度。

cAMP信号转导系统是由R、G-pr、AC偶联而成。细胞外信号与受体结合使AC活化,后者催化ATP生成cAMP,cAMP激活了cAMP依赖的蛋白激酶(cAMP dependent protein kinase)或称蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)。PKA全酶分子由两类不同亚基构成的四聚体,即两个调节亚基和两个催化亚基(R2C2)。R亚基分子量为49~55kD,C亚基分子量为40kD,全酶(R2C2)复合体的分子量为180kD,等电点为5.3,最适pH在6~9之间,对ATP的Km值为6.7×10-6mol/L,其酶促反应需要Mg2+参与。

R2C2这种全酶四聚体并无催化活性,只有当cAMP结合至无活性全酶的R亚基时,导致R与C分离,形成有蛋白激酶活性的C亚基。

五、cGMP

cGMP依赖的蛋白激酶具有明显的增强精子运动能力的作用,其作用有调控离子通道、调节PDE2的活性、激活GPK以及与APK的交叉作用等。

cGMP结合位点的结构特点是3个α-螺旋,8个β-strand和反向平行排列的β-barrel形成一个带,环核苷酸结合到其内部。此位点序列中共保留6个不变的氨基酸作为核苷酸结合的关键组分,三个Gly具有维持结构的作用。一个Arg与cGMP环磷酸的氧化反应,一个Gly与核糖2'-羧基形成氢键,1个功能不明的Ala。

GPK催化结构域位于C端340位Ala到599Ala位Ser区,包括Mg2+/ATP结合位点和底物结合位点。在GPK366位Gly起始处存在ATP结合的GVGGFG共同序列,373位Val为高度保守。

六、G蛋白

是对一大类具有信号转导功能蛋白的总称。G蛋白是一种异构二聚体GTP结合蛋白,其活性受7个跨膜片段构成的受体调节。AC生物效应的发挥必须依赖G-蛋白。

G蛋白有三型亚基,即α、β、γ。α亚基上有GTP结合位点、受体结合点、GTPase活性部位。β 和γ亚基紧密连在一起,是辅助因子,对α亚基起保护作用,并参与α亚基上GDP/GTP的转换及G蛋白与受体的结合过程。GTP和Mg2+等辅助因子可使α、β、γ亚基更易与质膜结合,从而和受体与AC发生作用。AC激活或抑制过程中发挥重要限速步骤的G蛋白的α亚基与β亚基的解离过程。

尽管对精子获能机制的研究已取得一些进展,但尚有不少问题仍待继续研究。例如,蛋白质酪氨酸磷酸化的增加是否就代表了精子获能的完成?除了PKA外,cAMP在获能中是否还介导其他下游信号途径?氧自由基作用的确切位点在哪里?而且,目前有关获能分子机制的研究主要集中于体外,体内生理性获能的分子机制究竟如何,都有待于进一步阐明。

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