精子获能发生机制及调控

精子获能启动的第一个重要环节是精子胞膜结构稳定性下降,包括胞膜结构组成成分中脂质和磷脂含量及分布的变化。这种变化导致膜结构改变以及流动性增强,进而增加胞外离子内流,启动相应的胞内第二信使物质,进而激活蛋白激酶,促进胞内分子蛋白酪氨酸磷酸化以及超激活运动。下面介绍精子获能过程中可能涉及的调控机制。

胆固醇流失与精子获能

精子获能过程中精子胞膜胆固醇含量减少。胆固醇/磷脂比率降低被认为能够增加膜流动性,尤其是精子顶体膜处胆固醇的流失是精子获能过程的关键步骤。胆固醇与精子胞膜结合不紧密,容易从胞膜上分离出去,精子获能率与精子胞膜胆固醇被剥脱率关系密切。研究提示,胆固醇含量低的精子似乎发生获能的速度要快于胆固醇含量高的。

胞膜脂质骨架序列中可流动脂质的减少很可能是固醇类调节精子获能的一种机制。早在1990年,Rosselli等发现胞膜标记了阳离子化铁蛋白的人精子穿过黏液柱后,其胞膜上结合的阳离子化铁蛋白消失了。Feki等于2004年也报道了当精子通过排卵期宫颈黏液时,其细胞膜胆固醇减少近一半。最近的体外研究也显示,显著增加膜脂质流动性并不能相应增强精子获能状态,提示精子膜结构中脂质减少激发精子获能。

精子获能过程中胆固醇是怎样减少的呢?推测胆固醇可能被宫颈黏液里的白蛋白结合吸附。白蛋白被认为是胆固醇的受体,精子周围环境中的白蛋白能够吸附掉精子胞膜上高达40%的胆固醇,可以调节胆固醇。但是白蛋白的吸附作用必须要求有碳酸氢盐的存在。Visconti等研究显示,牛血清白蛋白(BSA)-胆固醇不仅可以抑制BSA结合吸附精子膜上的胆固醇,还可以抑制精子获能以及蛋白质酪氨酸磷酸化。这一研究结果支持白蛋白参与精子膜胆固醇流失的调节。然而,宫颈黏液中的白蛋白浓度只能结合流失胆固醇总量的20%~30%,提示至少还有其他物质参与精子获能时胞膜胆固醇含量变化的调节。环糊精是另一种被证实能够刺激细胞膜胆固醇流失的物质。β-环状糊精具有与天然合成的脂类分子相互作用的结构。将甲基-β-环状糊精与精子共孵育90分钟后,精子膜上未酯化胆固醇的流失率高达45%,明显高于白蛋白的作用;同时还能增加蛋白质酪氨酸磷酸化的能力。此外,高密度脂蛋白HDL也被发现能较好地与胆固醇结合。

胞内离子与精子获能

Ca2+是调节精子获能重要的第二信使分子。当牛精子孵育在获能培养液内,精子胞内Ca2+浓度([Ca2+i)增加6倍,增加的[Ca2+i激活Ca2+-依赖的三磷腺苷酶(ATPase)以及环磷酸腺苷酶(AC),进而激活相应的信号途径。相反去掉精子周围环境中的Ca2+则抑制精子获能,但不影响蛋白酪氨酸磷酸化的进行,提示Ca2+与蛋白酪氨酸磷酸化在精子获能中的调控机制并不相同。在精子获能培养液内分别加入6种钙调蛋白抑制剂均可以抑制精子获能发生。其中有三种抑制剂可同时影响精子存活率和蛋白酪氨酸磷酸化,提示在精子获能过程中Ca2+-钙调蛋白激活了不同的下游信号途径,其中包括PKA相关的蛋白酪氨酸磷酸化途径。也证实了Ca2+与钙调蛋白结合激活多条细胞内信号途径,是Ca2+调节多种精子细胞功能的作用机制之一。

Ca2+与获能相关的超激活运动关系也十分密切。在绝大多数哺乳动物,超激活运动已作为精子获能的一种标志性运动形式。精子的超激活运动是以高振幅和不对称的鞭击运动为特征,其运动方式有助于精子从输卵管壶腹部的储存部位释放出来,有利于精子穿过输卵管腔内的黏液以及卵细胞外包裹的卵丘基质,从而促进精子穿过透明带与卵子结合,完成受精。去膜精子模型已被大量用来研究精子超激活运动。当逐渐增加去膜牛精子周围液体内的Ca2+浓度达到100nM时,开始有精子出现超激活运动,当增加到400nM时,超激活运动的精子数目达到最高。高浓度Ca2+能够选择性调节去膜海胆精子的动力臂,从而诱导精子出现典型的尾部弯曲运动形式。以上研究结果提示:精子获能相关的超激活运动发生是由Ca2+信号转导途径所介导。超激活运动时精子胞内Ca2+主要来源于胞外Ca2+内流。已经在精子胞膜上鉴定出多种Ca2+通道,包括:CatSper、电压门控Ca2+通道、瞬时性电压感受器通道和环核苷酸门控Ca2+通道。电生理研究显示超激活运动时内流Ca2+主要经CatSper进入精子体内。CatSper敲除小鼠精子不能产生超激活运动,不能穿透透明带,提示CatSper对精子超激活运动的调节起着关键作用。

在哺乳动物,HCO3-通过改变精子胞内pH从而在精子获能过程中发挥重要作用。研究显示以NaCl替换培养液内的NaCHO3后精子胞内pH下降,获能精子数量相应显著下降;用HEPES替代培养液内的NaCHO3可以阻断仓鼠精子获能发生。但是,HCO3-诱导获能的机制并不是单纯升高胞内

pH,因为单纯升高精子胞内pH而不是用HCO-

3其诱导的精子获能率很低。HCO3-诱导精子获能的机制主要与其效应感受器——一种特殊的可溶性的腺苷酸环化酶(sAC)有关。获能时,HCO3-进入精子胞内,引起细胞内胆固醇外流和sAC活化,促进胞内cAMP合成,cAMP激活蛋白激酶(PKA)信号通路,增加胞内蛋白酪氨酸磷酸化程度,从而在获能中发挥作用。另外,PKA被激活后还能够促进精子顶体外膜上的电压依赖性Ca2+通道打开,使[Ca2+i升高;升高的[Ca2+i则激活磷脂酶C,促进磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)生成,PIP2作用于蛋白激酶C,引起精子质膜上电压依赖性Ca2+通道开放,再次升高[Ca2+i,最后诱发质膜溶解和顶体反应发生等生物学效应。HCO3-进入胞质内的机制还不完全清楚,可能与下面几个途径有关:①Na+依赖的Cl--HCO3-交换;②肝素与肝素结合蛋白结合可能活化精子膜上阴离子运输蛋白。③输卵管液中HCO3-浓度高于附睾液中HCO3-浓度,输卵管液中高水平的HCO3-可能有助于精子获能。

蛋白酪氨酸磷酸化与精子获能

蛋白磷酸化是一种翻译后调节机制,通过磷酸化/去磷酸化蛋白改变蛋白活性,从而参与调控多种细胞活动过程。精子是终末分化细胞,主要的转录和翻译活动基本停止,因此,蛋白磷酸化/去磷酸化成为调节精子功能活动的一种重要调控机制。前期研究已经证实,多种磷酸化蛋白、蛋白激酶和蛋白质磷酸酶存在于哺乳动物精子内,并涉及精子多项生理活动,如精子运动能力获得、获能、超激活运动和顶体反应等。最常见的磷酸化位点是丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基。精子体内同时存在酪氨酸蛋白磷酸化和丝/苏氨酸蛋白磷酸环,但是,酪氨酸蛋白磷酸化似乎发挥了主要作用。

1998年,Leyton和Saling首次报道在小鼠精子获能以及与卵透明带蛋白结合过程中检测到酪氨酸蛋白磷酸化存在。以后相继在多种哺乳动物精子内检测到多种酪氨酸磷酸化蛋白。获能时发生酪氨酸磷酸化的精子数量以及单个精子的酪氨酸磷酸化程度均明显增加。除牛外,大多数哺乳动物精子尾部的蛋白在获能时经历了蛋白酪氨酸磷酸化,且最先发生于精子主段,其次是精子中段。一旦获能,酪氨酸磷酸化的蛋白由精子尾部迁移到顶体区,与即将发生膜融合和顶体反应的需要保持一致。精子尾部蛋白酪氨酸磷酸化还与获能相关的超激活运动密切相关。将一种酪氨酸激酶抑制剂加入到获能液里,能够同时抑制与获能相关的蛋白酪氨酸磷酸化以及精子超激活运动的发生。

体外研究表明,精子获能时发生的蛋白酪氨酸磷酸化可能是精子胞内cAMP水平升高后的结果,与PKA途径有关。细胞内cAMP升高可促进PKA活性增加,其活化酪氨酸蛋白激酶或抑制酪氨酸磷酸酯酶,导致蛋白酪氨酸磷酸化增加。研究显示,分别将两种PKA抑制剂加入精子获能培养介质中,均可以在抑制蛋白质酪氨酸磷酸化的同时抑制精子获能。这一研究结果支持PKA途径参与精子获能的调节。有实验研究显示:磷酸二酯酶抑制剂和磷酸丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶抑制剂可促进O2-产生,而蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂则抑制O2-的产生。这一结果提示,cAMP可通过抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸化而促进O-2产生,进而影响蛋白质酪氨酸磷酸化。因此,蛋白酪氨酸磷酸化可能是精子获能分子水平上的最终结果。然而,值得注意的是,精子蛋白酪氨酸磷酸化的增加并不总是与获能相关。例如,还原剂二硫苏糖醇(DTT)抑制胎儿脐带血清超滤物(FCSu)诱导的精子获能,但却促进精子纤维鞘蛋白p105/p108的酪氨酸磷酸化;1mol/L的NADPH 或NADH不能促进精子获能,但却刺激蛋白酪氨酸磷酸化增加。因此,蛋白酪氨酸磷酸化可能与精子获能相关,但并非获能的唯一途径。

氧化还原反应与精子获能

正如在许多生物系统中观察到的,氧化还原反应在精子信号传递机制中起重要作用,包括精子获能机制。活性氧簇(ROS)由白细胞和精子自身产生,对精子产生双刃剑样影响:一方面ROS有害于精子膜脂质,另一方面却能促进精子获能。维生素E(Vitamin E)是一种有效的氧化保护剂,存在于精子膜表面,能够保护精子膜脂质免遭氧化反应破坏。当精子接触到宫颈黏液后,精子膜上结合的Vitamin E被剥脱,对于未成熟和形态异常的精子来说,这些精子对ROS的损害影响非常敏感,本身也产生较多ROS。膜结合Vitamin E的丢失会加重ROS对其产生的损害,导致精子死亡或不能正常迁移。而对于正常精子来说,移除膜结合的Vitamin E后,有利于ROS介导的获能发生。

一般认为,低剂量的氧自由基对精子获能是必需的,O2-、巯基(—SH)氧化剂、H2O2及OH-皆可启动精子获能。经测定,精子获能过程伴随O2-的产生。获能初期(孵育开始后15~20分钟内)即产生较高水平的O2-,随后逐渐降至较低水平,甚至比非获能精子水平还低。实验显示,超氧化物歧化酶(SOD)能够阻止由胎儿脐带血清超滤物(FCSu)、卵泡液超滤物(FFu)、精浆超滤物(SPu)及孕激素(P)等诱导的精子获能。但是延迟加入SOD(孵育开始后30分钟和60分钟时加入)不阻止精子获能,支持O2-是在获能初期启动精子获能的观点。

氧自由基导致精子蛋白质酪氨酸磷酸化增加的机制目前还不清楚。O2-和H2O2抑制磷酸酪氨酸磷酸酯酶可能是作用途径之一;由于蛋白激酶C、Ca2+通道、磷脂酶A2和D等也受氧自由基调节,且O2-可直接或间接地刺激人精子AC导致cAMP增加,氧自由基可能通过影响其他信号传递机制而起作用。

—SH氧化剂可增加O2-的产生,启动精子获能;而二硫键(—S—S—)还原剂可部分或完全抑制FCSu诱导的获能和O2-的产生,同时伴随蛋白质酪氨酸磷酸化的降低。—SH氧化剂通过氧化磷酸酪氨酸磷酸酯酶活化位点上的两个半胱氨酸使其丧失活性,来增加蛋白质酪氨酸磷酸化;同时,氧化还原反应过程中产生O2-,二者都对精子获能有重要作用,而且O2-极有可能充当体内巯基氧化剂。

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