精子膜甾体激素受体(孕激素受体、雌激素受体)

经典观点认为,甾体激素以自由扩散方式进入靶细胞后,与存在于细胞内的甾体激素受体相结合,形成激素-受体复合物。该激素受体复合物活化后,结合、作用于染色质的核蛋白和DNA特异区域,并通过与辅助因子、基础转录因子和其他转录因子相互作用,调控特靶基因的转录和表达,从而发挥甾体激素的作用。已有资料表明,雌激素、孕激素等甾体激素的受体位于细胞核内;糖皮质激素受体、盐皮质激素受体在胞核及胞质内均存在。甾体激素通过这种基因机制产生效应的潜伏期较长,一般需数小时甚至数天。然而,随着研究的深入和发展,人们发现,甾体激素的许多效应很难用这种经典的甾体激素作用理论解释,表明甾体激素基因机制并非其唯一作用模式,有可能存在一种甾体激素非基因组作用模式,即:细胞膜上存在着甾体激素受体,甾体激素能直接作用于这种受体而产生效应。提出此假设的主要依据有:

  1. 甾体激素作用快速,潜伏期短,其作用具剂量依赖性;
  2. 甾体激素作用不直接涉及mRNA、蛋白质合成的变化,其作用不被mRNA、蛋白质合成的抑制剂所阻断;
  3. 耦联大分子物质的甾体激素虽然不能进入细胞内,但仍能发挥作用;
  4. 细胞膜上存在甾体激素特异性结合位点或受体,具有不同化学结构的同类甾体激素,产生的效应不同。

已有许多研究表明,哺乳动物的肝、腺垂体、子宫、输卵管、前列腺、附睾、睾丸等器官的细胞膜上含有甾体激素的结合位点。20世纪70年代后期,有人发现甾体激素如雌激素、孕激素能影响精子功能,但成熟精子核高度浓缩,基因关闭,在精卵核融合前,细胞外物质作用于精子,一般不涉及精子基因组变化。故此,甾体激素对精子功能的影响,只能直接通过精子膜而发生。近年来,陆续有许多文献报道,哺乳动物精子膜上有孕激素、雌激素的膜结合位点或受体。

精子膜孕激素受体

人及哺乳动物精子产生于睾丸,在附睾移行过程中,获得了运动和受精能力,达到结构和功能上的成熟。但人及哺乳动物精子在离开雄性生殖管道时,并不能立即使卵子受精,必须先在雌性生殖管道内经历一段生理成熟过程即“获能”。在生理条件下,精子获能发生于雌性生殖管道,自子宫颈开始,经过子宫,最后完成于输卵管壶腹部。输卵管液和卵泡液是诱导精子获能的重要环境因素,近期有许多资料表明,孕酮和17α-羟孕酮是输卵管液、卵泡液中诱导精子获能的最重要成分,在人卵泡液中孕酮浓度高达5μmol/L,主要由卵丘细胞产生。孕酮诱导精子获能的机制还未能最后阐明,但精子结构的特殊性以及大量实验提示,孕酮诱导精子获能不可能通过新蛋白质合成而只能通过与膜有关的机制介导,即在精子膜上存在孕激素受体。目前,表明精子膜存在孕激素受体的主要证据有:

一、孕酮可促进精子外Ca2+快速内流,使精子内游离Ca2+([Ca2+i)立即升高。孕酮的这一作用有明显剂量依赖性,最小效应的剂量在10-8~10-9 mol/L范围内,最大剂量在10-5~10-6 mol/L范围内。

二、获能精子具有特殊的高度活跃运动(hyperactivated motility,HA)方式,以HA为指标,观察孕酮及其核内受体特异性阻断剂RU486、ZK98299对精子获能的影响,发现孕酮能以剂量依赖性方式快速诱导精子HA,但RU486、ZK98299都不能阻断其效应;同时,人工合成的孕酮类似物能作用于核内孕酮受体,但不能模拟孕酮对精子的效应,表明孕酮不是通过核内受体,而是直接作用于精子膜激发精子获能。

三、耦联牛血清白蛋白(BSA)的孕酮不能穿过细胞膜进入精子内,但仍能快速促进精子[Ca2+i升高,诱导精子获能和顶体反应。进一步的研究表明,耦联BSA的孕酮能紧密地结合于精子膜,主要集中在精子头部顶体区。

四、应用人工合成125I孕激素受体配基标记精子质膜,发现精子质膜有两种孕激素结合位点,鉴定出纯化后的膜结合位点分子量分别为54kDa和57kDa。其中,P54位点和孕激素亲和力高,平衡解离常数(Kd)为nmol/L水平,表明为孕酮高度特异;P57位点亲和力较前者低,(Kd)为nmol/L水平,11β-羟孕酮和17α-羟孕酮与其亲和力基本一致,表明其特异性不高。Western blot分析显示,孕激素核受体的孕酮结合区C262单克隆抗体能识别P54、P57,而其DNA结合区及N末端的单克隆抗体不能识别P54、P57;在精子胞质中也无P54、P57。并且C262能抑制孕酮诱导的精子获能和顶体反应,表明精子膜孕激素受体或结合位点和核内孕激素受体有共同的孕激素结合区,但无核内受体的DNA结合区。

精子膜孕激素受体类型

有关精子膜孕激素受体的研究常常有相互矛盾的结果,如:早期文献报道,孕激素能诱导正常男性10%的射出精子发生顶体反应,这些精子膜都有孕激素结合位点。另一些实验又称,正常男性射出精子的大部分膜上无孕激素受体活性。而近期文献报道,孕激素能诱导90%射出精子[Ca2+i升高,存在膜孕激素受体的精子明显高于前期报道,达90%以上,等等。射出精子对孕激素不同的反应性以及精子膜孕激素受体实验结果的多样性提示,精子膜可能存在不同类型的孕激素受体。总结目前已有的资料,推测精子膜至少存在3种不同类型的孕激素受体。

  1. Ⅰ型孕激素受体(PR1):PR1可能与精子膜Ca2+通道为同一复合物。该受体和精子[Ca2+i快速升高密切相关,90%以上的射出精子该受体具有活性。
  2. Ⅱ型孕激素受体(PR2):为酪氨酸蛋白激酶型受体。该受体激活后,精子对生理浓度的孕酮敏感性将有较大提高。孕酮诱导的精子顶体反应可能与其有关。
  3. Ⅲ型孕激素受体(PR3):耦联Cl-通道,类似于GABAA受体/ Cl-通道,主要诱导顶体反应过程中Cl-外流,也可引起Ca2+进一步内流。因此,孕酮作用于精子可能由多受体系统介导,其中,某一受体异常就有可能导致精子正常功能丧失。

孕激素对精子的作用及其机制

总结相关研究资料,孕激素对精子的作用主要表现在以下几个方面:①快速升高精子[Ca2+i,并促进精子Cl-外流;②诱导精子获能,并能进一步使获能精子发生顶体反应;③对精子具有趋化性,促进并参与精卵融合。孕激素对精子的上述作用是通过精子膜孕激素受体实现的。

孕激素能在数秒内启动精子[Ca2+i的第一次升高,20s左右精子[Ca2+i达其最高峰,研究证实参与该过程的精子膜受体是PR1。PR1经孕激素激活后,Ca2+通道开放,引起胞外Ca2+快速内流,从而使精子[Ca2+i升高。许多资料表明,睾丸生精细胞能表达不同类型的Ca2+通道,如T型(过渡型)-Ca2+通道;在成熟精子质膜、顶体内外膜等精子膜系中也已发现有多种Ca2+通道存在,包括L型(持续型)-Ca2+通道,获得性Ca2+通道(capacitative Ca2+channel)、IP3敏感性Ca2+通道,等等。涉及PR1的通道可能是一种非电压依赖性通道,并且它的开放和关闭与G蛋白、酪氨酸蛋白激酶无关。

精子获能和顶体反应分属同一事件的不同时相,前者是后者的基础,后者是前者的发展结果,而精子[Ca2+i升高是两者发生的必要条件,但精子获能和顶体反应分别需要不同浓度的Ca2+,获能只需nmol/ L水平的[Ca2+i,而后者所需[Ca2+i达μmol/L级,所以孕激素诱导精子[Ca2+i第一次升高至峰值时,已足以诱导精子获能,但可能不足以使精子发生顶体反应。然而,精子[Ca2+i第一次升高后,可以再通过以下两条信号途径放大其效应,进一步增加[Ca2+i。其一为cAMP途径。Ca2+和cAMP两种系统能在各种水平上以协同或拮抗的方式相互影响,但这种效应取决于细胞类型和细胞反应过程。就孕激素对精子作用而言,升高精子[Ca2+i可活化腺甘酸环化酶或者抑制磷酸二酯酶(PDE),使精子内cAMP水平增加;而cAMP可作用于精子顶体膜cAMP依赖性Ca2+通道,导致精子内钙池顶体释放至胞质,进一步升高精子[Ca2+i。其二为DG-IP3途径。在精子膜系中存在着两种类型的磷脂酶C(PLC),一种是特异性磷脂酰胆碱PLC(PC-PLC),另一种为特异性磷脂酰肌醇PLC(PI-PLC),前者活性对Ca2+不敏感,后者活性依赖于Ca2+。精子[Ca2+i升高至一定水平,可激活精子膜PI-PLC,水解精子膜磷脂酰肌醇生成二酰基甘油(DG)和1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)。随后,DG活化精子内广泛分布的蛋白激酶C,进而使精子膜上的电压依赖性Ca2+通道磷酸化并开放;IP3通过与存在于精子顶体外膜上的特异性受体结合,开放IP3敏感性Ca2+通道,诱发顶体大量释放Ca2+。此外,PR1的Ca2+通道对离子选择性不甚严格,其开放后,除Ca2+内流外,也有大量Na+内流。Na+内流会导致精子膜去极化,这已被实验所证实。精子膜的去极化引起了膜电压依赖性Ca2+通道的开放,促使Ca2+内流。故此,孕激素通过与PR1结合造成的第一次精子[Ca2+i升高能诱发更进一步的Ca2+内流,这可能与精子顶体反应的发生有关。

目前资料表明,绝大部分精子膜存在着PR1,因为几乎所有精子经孕激素作用后都能发生第一次[Ca2+i升高;而大约只有10%精子膜存在着PR2。孕激素和PR2结合后,受体构象发生变化,引起受体在数分钟内聚集,形成寡聚化的受体配体复合物;5~10min受体活化,造成精子膜蛋白酪氨酸残基磷酸化。精子膜蛋白分离实验证实,发生酪氨酸残基磷酸化的蛋白主要是精子膜蛋白。相对分子质量为94 000的蛋白是精子特异蛋白,位于精子顶体区,它不仅是PR2中酪氨酸蛋白激酶的底物,也可能是透明带蛋白ZP3受体。这种蛋白的磷酸化使膜电压依赖性Ca2+通道开放,促进Ca2+内流;此外,PTK与Ca2+一样也能激活PI-PLC,使磷脂酰肌醇水解为DG和IP3,如前述,后者能导致Ca2+内流和顶体内Ca2+释放,甚至PTK还能直接活化顶体膜IP3门控Ca2+通道,使其开放、释放Ca2+于胞质内。这样,孕激素和PR2结合也造成了精子[Ca2+i升高,但其至少发生于孕酮和精子作用后5min,并且其作用不依赖于精子第一次[Ca2+i升高。通过PR2引起的精子[Ca2+i升高被认为与精子顶体反应直接相关。

近期研究表明,孕酮可以使CatSper开放,因此推测,CatSper或与之相连的蛋白可能是孕酮在精子膜上的受体。

精子Cl-外流是孕激素诱导精子发生顶体反应的基本因素之一,但它与精子获能无关。有研究表明,孕激素能和GABAA受体激动剂muscimol一样诱发精子顶体反应;同时,GABAA受体/Cl-通道阻断剂bicuculline可显著抑制孕激素诱导的精子顶体反应。这些都有力地证明了精子膜上存在着GABAA受体/ Cl-通道复合物,并提示该复合物和精子膜的某些孕激素受体可能是同一复合体,即前文所述的PR3。当孕激素结合于PR3后,激活GABAA受体/Cl-通道复合物,导致Cl-外流,使精子膜超极化,产生一个依赖超极化的H+外流,而同时存在的Cl-和HCO3-协同运输造成HCO3-内流,这些都使精子内pH值升高,进而激活膜Ca2+通道,引起精子[Ca2+i升高。最近有文献报道,PTK抑制剂能抑制孕激素诱导的Cl-外流,据此推测,精子膜GABAA受体/Cl-通道还可能和PTK相耦联,形成一功能复合物,当PTK激活后,不但能造成精子第二次[Ca2+i升高,而且会引起Cl-外流。

综上所述,孕激素通过作用于精子膜上的PR1、PR2、PR3、CatSper等,引发了精子[Ca2+i双相升高和Cl-外流,这些是孕激素诱导精子获能和顶体反应的基本因素和必要条件。一般认为,精子内Ca2+主要通过以下途径发挥作用:①Ca2+以及活化的PTK能激活精子膜系的PKC和磷脂酶A2(phospholipase A2,PLA2),PLA2使磷脂酰肌醇二磷酸酯(PIP2)裂解,生成大量溶血性卵磷脂,增加了精子膜、顶体内外膜的流动性,使精子质膜和顶体膜易于融合;同时,PIP2的裂解使存在于精子质膜和顶体膜之间、顶体后区致密鞘与精子质膜之间的多聚性肌动蛋白单体化,减少了精子质膜和顶体外膜融合的阻力。②Ca2+直接结合于顶体外膜,中和其磷脂极性端负电荷,以利于精子膜和顶体外膜融合。③Ca2+作用于膜融合相关蛋白,使其构象变化,促进膜融合。

需要指出的是,目前对诱导精子获能、顶体反应(包括孕酮诱导)所需[Ca2+i升高涉及的膜Ca2+通道还有争论。有人认为,获能、顶体反应所需的Ca2+来源和Ca2+通道不同,前者Ca2+主要来源于胞外,膜Ca2+通道为非电压依赖性Ca2+通道;后者主要来源于精子钙池,Ca2+通道为电压依赖性。然而,最近的资料及体细胞的研究成果提示真实机制可能远比这复杂,如现在较为流行的钙池耗竭依赖性Ca2+内流(store-depletion dependent Ca2+influx)理论有可能也适用于孕酮诱导精子[Ca2+i升高机制,概述如下:精子外信号如孕酮激活其PR1以及PR2耦联的PTK,活化PI-PLC,水解磷脂酰肌醇为IP3和DG,进而IP3激活精子钙池,精子顶体在释放Ca2+的同时,通过目前尚不清楚的途径作用于精子膜,再由还不知道的机制激活精子膜上的一种或多种Ca2+通道如获得性Ca2+通道,使其开放,造成Ca2+内流。

有趣的是,精子cAMP依赖性蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)的锚蛋白也是PTK的胞浆作用底物之一,这提示PKA途径与PTK信号途径可能有交叉。

精子膜孕激素受体病理生理学

精子膜孕激素受体异常能造成男性不育。Tesarik等发现一些不明原因的不育症患者精子Ca2+内流及顶体反应障碍与精子膜孕激素结合能力低下显著相关;Ochnirger等研究显示畸形精子症病人的精子,孕酮诱导其顶体反应无效;Falsetti等报道少精子症患者的精子对孕酮敏感性也大为降低甚至消失,等等。最近,Kiansz等研究表明孕酮诱导精子顶体反应率与精子受精能力呈正相关,这可以作为诊断精子受精能力的非常有价值的指标。

精子膜雌激素受体

精子膜可能存在着雌激素受体,有以下证据表明:

  1. 精子膜有17β雌二醇(17β-E2)的特异性低亲和力的结合位点,放射自显影研究表明其他甾体激素尤其是孕激素能与17β-E2竞争该膜结合位点。
  2. 后续研究显示精子膜还存在着高亲和力的17β-E2特异性受体。采用经同位素标记的人工合成的雌激素受体配基标记精子,鉴定出精子雌激素结合蛋白约有75%~85%为质膜蛋白,核内蛋白约有10%,而胞液中无雌激素结合蛋白。
  3. 精子膜17β-E2受体主要集中于鞭毛中段。
  4. 精子核高度浓缩,其基因关闭。

总结已有资料,雌激素对精子的作用主要表现在以下几个方面:①使精子代谢活化,糖和能量利用大幅增加,精子摄O2能力也增加,并激活了精子的运动能力;②显著减少外因诱导的精子凝集;③增加精子半透明带结合试验(HZA)指数。

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