评估精子核成熟度的临床意义
哺乳类动物精子核所呈现的复杂结构形式似乎反映了DNA功能意义的组织方式。这种严密、复杂形式的生物学意义可能表现在以下几个方面:①精核蛋白为高度碱性的核蛋白,故较组蛋白更易与DNA结合,中和DNA链上的负电荷,使染色质高度浓缩,并能通过与分子内和分子间形成二硫键,使核结构高度稳定,精子基因在此种碱性蛋白的保护下,在漫长的受精前过程中紧密浓缩,不发生转录;②通过这种组织形式将严密顺序的遗传信息导入卵子;③由于这种严密的组织形式,可以将这些信息以恰当的生理化学组织方式传递;④使这些信息能准确无误的进入胚胎,从而保证胚胎的遗传性状和维持胚胎的正常发育。那么有哪些不育类型,或者说精子质量与DNA有关?与精子核有关?头部异常和颈部异常是精子发生阶段的,而尾部异常则多为精子发生阶段后的。
精子核成熟度检测方法
已如上述,检测精子核成熟度有以下几条途径:一是检测DNA功能状态;二是检测组蛋白含量和与DNA空间构型;三是中间型碱性核蛋白的含量,与DNA空间构型,转换机制;四是精核蛋白的含量,空间构型,二硫键分子筑型形式等。这些检查均是常规精液分析无法达到的。
精子核成熟度检查中的苯胺蓝染色法
- 禁欲3~5d,手淫法留取精液;
- 37℃水浴箱中温育至完全液化;
- 以BWW培养液调整精子浓度为10~20×106/ml;
- 均匀涂片;
- 自然干燥;
- 3%戊二醛固定30min;
- 空气干燥20min;
- 5%苯胺蓝染色3~5min;
- 95%乙醇洗1次;
- 100%乙醇洗2次;
- 二甲苯透明2次(5~10min);
- 加拿大树胶封片;
- 计数400条精子中着色和非着色百分率。
结果解释:①不成熟的精子头部着色深;②正常情况下精子头部着色率不应超过35%。
吖啶橙诱发荧光试验(AO-Test)
一、Krebs-Ringer贮备液的配制
- 0.9% NaCl 80份
- 1.15% KCl 4份
- 0.11mol/L CaCl2 3份
- 2.11% KH2PO4 1份
- 3.82% MgSO4•7H2O 1份
二、Krebs-Ringer缓冲液的配制(pH6.0~6.5)
0.1mol/L PBS稀释Krebs-Ringer贮备液
三、AO贮备液的配制
1g AO+1000ml双蒸水
四、AO工作液的配制
- AO贮备液1份
- Krebs-Ringer缓冲液9份
五、在AO试验中还可以用TC
- Tyrode液
- TC Tyrode液的配制:
- CaCl2 0.2g/L
- KCl 0.2g/L
- NaH2PO4 0.05g/L
- MgCl2•6H2O 0.2g/L
- NaCl 8.0g/L
- NaHCO3 1.0g/L
- 葡萄糖 1.0g/L
- 牛磺胆酸 1.0g/L
六、Carnoy液的配制
- 甲醇 3份
- 冰醋酸 1份
七、还有学者主张用另一种AO工作液(pH2.5)
- AO贮备液 10ml
- 0.1mol/L枸橼酸 40ml
- 0.3mol/L NaH2PO4•7H2O 2.5ml
- (这种工作液可在4℃冰箱中避光保存1个月不影响显色效果)
八、操作程序
- 完全液化的新鲜精液1ml;
- 加3ml TC Tyrode液;
- 1300g离心5min;
- 弃上清液;
- 加3ml TC Tyrode液;
- 1300g离心5min;
- 弃上清液;
- 以Tyrode液调整精子浓度为20~50×106/ml
- 空气干燥20min;
- Carnoy液固定2h;
- 自然干燥3~5min;
- 放入AO工作液中显色5~7min;
- 荧光封固剂封片;
- 荧光显微镜观察,并立即照相;
- 波长要求490mm,滤色片要求530mm。
九、结果
- 计数400条精子中精子头部呈红色荧光、绿色荧光、黄色荧光的百分率;
- 绿色荧光为正常成熟的精子核,红色荧光为精子核单股链DNA,黄色荧光为染色质分子变性;
- 由于任何一份标本均有一定量的精子核异常,故必须进行重复试验,以及尽量准确的计数不同荧光着色的精子数。
精子核总碱性蛋白提取法
一、精液标本的制备
- 手淫法留取新鲜精液;
- 37℃温育至完全液化;
- -30℃低温冰箱中贮存。
二、总碱性蛋白的提取
- 精液标本逐步回温至室温;
- 用0.85%NaCl洗涤2次;
- 900g离心10min;
- 弃上清液;
- 以等量5mol/L盐酸胍溶解;
- 加入1mol/L HCl;
- 冰浴15min;
- 1200g离心10min;
- 弃上清液;
- 沉淀物用0.25mol/L HCl提取一次;
- 取两次上清液混匀;
- 加入60%三氯醋酸;
- 冰浴30min;
- 1200g离心15min;
- 沉淀物用冷丙酮洗涤;
- 离心;
- 提取的碱性蛋白真空干燥。
三、各电泳条带的相对含量测定
- 在酸性尿素系统-聚丙酰胺凝胶中电泳;
- 电泳胶用0.1%氨基黑染色;
- 乙醇脱色;
- 拍照;
- 微显像测密仪上扫描各蛋白条带;
- 计算总组蛋白/总碱性蛋白相对含量值;