人类精子核成熟度的评价

评估精子核成熟度的临床意义

哺乳类动物精子核所呈现的复杂结构形式似乎反映了DNA功能意义的组织方式。这种严密、复杂形式的生物学意义可能表现在以下几个方面:①精核蛋白为高度碱性的核蛋白,故较组蛋白更易与DNA结合,中和DNA链上的负电荷,使染色质高度浓缩,并能通过与分子内和分子间形成二硫键,使核结构高度稳定,精子基因在此种碱性蛋白的保护下,在漫长的受精前过程中紧密浓缩,不发生转录;②通过这种组织形式将严密顺序的遗传信息导入卵子;③由于这种严密的组织形式,可以将这些信息以恰当的生理化学组织方式传递;④使这些信息能准确无误的进入胚胎,从而保证胚胎的遗传性状和维持胚胎的正常发育。那么有哪些不育类型,或者说精子质量与DNA有关?与精子核有关?头部异常和颈部异常是精子发生阶段的,而尾部异常则多为精子发生阶段后的。

精子核成熟度检测方法

已如上述,检测精子核成熟度有以下几条途径:一是检测DNA功能状态;二是检测组蛋白含量和与DNA空间构型;三是中间型碱性核蛋白的含量,与DNA空间构型,转换机制;四是精核蛋白的含量,空间构型,二硫键分子筑型形式等。这些检查均是常规精液分析无法达到的。

精子核成熟度检查中的苯胺蓝染色法

  1. 禁欲3~5d,手淫法留取精液;
  2. 37℃水浴箱中温育至完全液化;
  3. 以BWW培养液调整精子浓度为10~20×106/ml;
  4. 均匀涂片;
  5. 自然干燥;
  6. 3%戊二醛固定30min;
  7. 空气干燥20min;
  8. 5%苯胺蓝染色3~5min;
  9. 95%乙醇洗1次;
  10. 100%乙醇洗2次;
  11. 二甲苯透明2次(5~10min);
  12. 加拿大树胶封片;
  13. 计数400条精子中着色和非着色百分率。

结果解释:①不成熟的精子头部着色深;②正常情况下精子头部着色率不应超过35%。

吖啶橙诱发荧光试验(AO-Test)

一、Krebs-Ringer贮备液的配制

  1. 0.9% NaCl 80份
  2. 1.15%  KCl  4份
  3. 0.11mol/L  CaCl2  3份
  4. 2.11%  KH2PO4 1份
  5. 3.82%  MgSO4•7H2O  1份

二、Krebs-Ringer缓冲液的配制(pH6.0~6.5)

0.1mol/L PBS稀释Krebs-Ringer贮备液

三、AO贮备液的配制

1g AO+1000ml双蒸水

四、AO工作液的配制

  1. AO贮备液1份
  2. Krebs-Ringer缓冲液9份

五、在AO试验中还可以用TC

  1. Tyrode液
  2. TC Tyrode液的配制:
  3. CaCl2 0.2g/L
  4. KCl  0.2g/L
  5. NaH2PO4 0.05g/L
  6. MgCl2•6H2O  0.2g/L
  7. NaCl  8.0g/L
  8. NaHCO3  1.0g/L
  9. 葡萄糖  1.0g/L
  10. 牛磺胆酸  1.0g/L

六、Carnoy液的配制

  1. 甲醇  3份
  2. 冰醋酸 1份

七、还有学者主张用另一种AO工作液(pH2.5)

  1. AO贮备液 10ml
  2. 0.1mol/L枸橼酸  40ml
  3. 0.3mol/L NaH2PO4•7H2O  2.5ml
  4. (这种工作液可在4℃冰箱中避光保存1个月不影响显色效果)

八、操作程序

  1. 完全液化的新鲜精液1ml;
  2. 加3ml TC Tyrode液;
  3. 1300g离心5min;
  4. 弃上清液;
  5. 加3ml TC Tyrode液;
  6. 1300g离心5min;
  7. 弃上清液;
  8. 以Tyrode液调整精子浓度为20~50×106/ml
  9. 空气干燥20min;
  10. Carnoy液固定2h;
  11. 自然干燥3~5min;
  12. 放入AO工作液中显色5~7min;
  13. 荧光封固剂封片;
  14. 荧光显微镜观察,并立即照相;
  15. 波长要求490mm,滤色片要求530mm。

九、结果

  1. 计数400条精子中精子头部呈红色荧光、绿色荧光、黄色荧光的百分率;
  2. 绿色荧光为正常成熟的精子核,红色荧光为精子核单股链DNA,黄色荧光为染色质分子变性;
  3. 由于任何一份标本均有一定量的精子核异常,故必须进行重复试验,以及尽量准确的计数不同荧光着色的精子数。

精子核总碱性蛋白提取法

一、精液标本的制备

  1. 手淫法留取新鲜精液;
  2. 37℃温育至完全液化;
  3. -30℃低温冰箱中贮存。

二、总碱性蛋白的提取

  1. 精液标本逐步回温至室温;
  2. 用0.85%NaCl洗涤2次;
  3. 900g离心10min;
  4. 弃上清液;
  5. 以等量5mol/L盐酸胍溶解;
  6. 加入1mol/L HCl;
  7. 冰浴15min;
  8. 1200g离心10min;
  9. 弃上清液;
  10. 沉淀物用0.25mol/L HCl提取一次;
  11. 取两次上清液混匀;
  12. 加入60%三氯醋酸;
  13. 冰浴30min;
  14. 1200g离心15min;
  15. 沉淀物用冷丙酮洗涤;
  16. 离心;
  17. 提取的碱性蛋白真空干燥。

三、各电泳条带的相对含量测定

  1. 在酸性尿素系统-聚丙酰胺凝胶中电泳;
  2. 电泳胶用0.1%氨基黑染色;
  3. 乙醇脱色;
  4. 拍照;
  5. 微显像测密仪上扫描各蛋白条带;
  6. 计算总组蛋白/总碱性蛋白相对含量值;

系统医学科普站点:天山医学院, 转载请注明出处:https://www.tsu.tw/edu/5236.html

小程序

内容拓展

中华皮肤病30年研究成果

心电图学一学就会

认识人体心脏,从解剖开始!

诱发心血管疾病的综合征

近视屈光激光手术矫正

适用于口腔科

做一个健康强健的男人!

智齿为萌出受阻的牙齿

内分泌与机体代谢医学