流式细胞术在精子(精液)检查中的应用

精液检查和睾丸活检,是临床判断男性生育能力的重要依据。FCM为客观地评价男性生育力提供了有利的条件。FCM在男科学研究中应用,把定性的描述过渡到定量研究,可进行数据统计,使实验结果的科学性大大提高,同时可采用穿刺的方法获取样本,并在必要时可多次穿刺,而不必睾丸组织活检,减少患者痛苦;在动物实验中,可不必杀死动物而行睾丸切片,故FCM在男性生殖生物学及男性计划生育研究中有其重要的应用前景。

精子细胞增殖周期定量分析

测定单个细胞内DNA含量是FCM最早、最普遍的用途,细胞成熟程度与DNA含量密切相关。精子发生过程可分为三个阶段:

  1. 精原细胞增殖时期:在增殖过程中,通过精原细胞的分裂和分化,由精原细胞产生初级精母细胞。
  2. 精母细胞成熟分裂时期:包括初级精母细胞和次级精母细胞的两次成熟分裂,即初级精母细胞经过一次DNA复制继而进行了两次细胞分裂,结果染色体数减少一半。
  3. 精子形成时期:由圆形精子细胞变形成为蝌蚪状的精子,在前减数分裂间期的DNA复制,初级精母细胞含有四倍体量的DNA(4C)。

经过第一次成熟分裂得到的两个次级精母细胞虽然染色体的数目减半,但由于每条染色体是由两条染色单体组成的,因而其DNA含量与精原细胞相同,为二倍体量的DNA(2C)。次级精母细胞经过第二次成熟分裂所形成的精子细胞,其每条染色体仅为一条染色体单体,DNA含量相当于初级精母细胞DNA含量的1/4(1C)。由计算机程控可按每个精子发生阶段的DNA含量绘制出DNA图形,并计算出各周期时相细胞的相对数量(G0/G1、S、G2+M%)以及各时相细胞的时间(TG1、TS、TG2、TM)或细胞周期时间(TC),故FCM可获得精液或睾丸组织中各类细胞相对比例的精确数据及精子形态学等指标,对精子发生障碍的性质和程度作出客观、精确的评价,在男性不育研究中,尤其是少精子症和无精子症的诊断疗效评价和预后估测,使用FCM具有明显优点。

检测生精细胞凋亡

细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定、由基因控制的细胞主动死亡过程。研究表明细胞凋亡的失控与许多疾病相关,包括男性不育症。生精细胞凋亡的检测有透射电镜观察法、末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)介导的脱氧核苷酸原位末端标记法(TUNEL)等方法。但这些方法操作繁琐、费时、主观性大,不宜常规使用。细胞发生凋亡时,会出现许多特征性的变化,如细胞核的改变和细胞膜成分的改变等,因此根据凋亡的这些特征采用不同的荧光染色方法结合FCM就能检测出精子凋亡情况。FCM检测细胞凋亡有其他方法不可比拟的优越性,既可定性又可定量,且具有快速、简单、客观、可靠等优点。

检测精子质膜完整性

精子的质膜组分对于精子质量有非常重要的作用。精子的质膜完整性是精子存活的基本条件之一,也是检测精液质量的重要指标之一。精子质膜维持和调节胞内成分,质膜破损会导致精子内环境失衡,最终导致精子死亡。碘化丙啶(PI)、溴乙锭(EB)、Hoechst 33258是用于死精子质膜特异性检测的荧光染料,其中PI最常用。它们是膜不通透性的DNA探针,只有质膜破损的精子才能允许染料进入细胞与DNA结合。检测活精子特异性的荧光染料有SYBR-14/羧基荧光素双醋酸盐(CFDA)、羟基二甲基荧光素双醋酸盐(CDMFDA)等,它们是膜通透性的染料,能进入质膜完整的精子。用SYBR-14/PI检测哺乳动物精子,用FCM进行定量分析,活精子被SYBR-14染成绿色,死精子被PI染成红色;同时染上两种荧光的双阳性精子表示正处于由活到死的过渡状态。

检测抗精子抗体

免疫珠试验(IBT)检出抗精子抗体为当前的标准试验法,但费时且有些主观。FCM为检测抗精子抗体提供了快速而极高的检出率,且具有高度敏感性和特异性,克服IBT的缺点。流式细胞计数的主要优点是对所给标本能以1000细胞/s速度分析10 000精子。相比IBT取决于人的视觉评分系统,总共仅检测100个可活动精子。

检测人精子顶体结构及预测生育力

运用流式细胞仪及人精子顶体特异性标记物结合异硫氰酸荧光素的花生凝集素检测精子顶体结构的完整性。表明人精子顶体结构的完整性与精子正常形态百分率、存活率、前向运动百分率正相关,而不育组精子在体外诱导发生顶体反应的能力明显低于生育组。故流式细胞仪能用于预测生育力。

检测精子线粒体功能

线粒体是精子的能量供应中心,其功能状态直接影响精子的活动力。用罗丹明(Rh123)和PI双染结合FCM可以检测精子线粒体功能,此方法具有快速、敏感度高的优点,改变以往检测线粒体功能的方法局限于对固定细胞的观察。Rh123是一种花青苷样荧光染料,呈绿色荧光,对线粒体有特异亲和性,正常生理条件pH时Rh123带正电荷,线粒体功能良好时,代谢旺盛,产生的能量多,把质子泵到线粒体内膜外,使线粒体膜上产生较高的跨膜负电荷,吸引并结合Rh123,通过FCM检测精子可分3群:PI(+) Rh123(-)为死精子;PI(-)Rh123(+)为线粒体功能良好的精子;PI(-)Rh123(-)为线粒体功能丧失的活精子。其绿色荧光越强,说明线粒体功能越好,精子活动力越强;反之精子活动力弱甚至缺乏。有学者还通过此方法研究一些药物(如米非司酮)对精子线粒体功能的影响。

检测精子染色质缩合度

精子染色质结构的稳定性对于精卵的正常结合及受精卵的发育均很重要。精子发生和成熟过程中,染色体呈减数分裂,核内染色质高度缩合,其缩合程度与精子成熟度有关。精子DNA与精核蛋白结合以平行线状排列的方式包装成很致密的体积而不发生超螺旋,核基质和核小体以特异的机制将致密的DNA组织起来,这对精子的正常功能有重要意义,不仅可以将致密的遗传信息导入卵子中,而且可进入胚胎遗传给下一代。用FCM结合DNA荧光染料(如PI)可以间接反映出精子染色质缩合度,从而反映精子的成熟度,判断其生育能力。随着精子病理程度增加,染色质缩合度降低,PI与DNA结合量增加,有研究表明弱畸精子症组DNA荧光值较正常生育组显著增高,且DNA荧光值与精子正常形态百分率负相关,提示精子形态与其染色质缩合程度存在密切关系。

精子染色体核型分析

FCM检测速度可达每秒108染色体。这种分析技术能快速分析染色体核型和分类收集不同类型的染色体,供进一步的专门研究。精子染色体结构异常,导致男性生育力下降。研究表明,染色体结构异常的精子较结构正常的精子耐高温的能力差,当加热至100℃持续5min,即出现部分结构异常的染色体双螺旋结构破坏现象,此时,用吖啶橙染色单链DNA呈红色荧光,双链DNA为绿色荧光,利用红色荧光与总荧光之比,流式细胞仪可反映不稳定染色体链的情况。另外,FCM进行细胞遗传学研究的另一特殊功能是用分类器可以纯化单一染色体型号。精子细胞有22条常染色体和1条性染色体,而性染色体可为X染色体或Y染色体,故精子细胞有X精子和Y精子两类,而X精子和Y精子的DNA含量不同。据此,FCM可描绘出不同的峰型,峰的面积代表这种类型染色体的丰度,从而可检出X、Y精子的比例。FCM还可用分类器收集纯化单一的X精子或Y精子。故FCM可应用于男科学遗传方面的研究。

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