X精子、Y精子分离纯度评价方法

到目前为止已经有很多方法用于精子分离纯度的鉴定分析:通过后代的性别比例来进行鉴定;通过胚胎性别鉴定对分离精子进行纯度评价;还有流式细胞仪重分析评价法、荧光原位杂交评价法、PCR评价法。然而这些评价方法各有优缺点。

一、出生性别鉴定评价法

通过统计出生性别比例评价精子的分离效率是最原始的评价方法,早期实验中大多采用这种方法。最准确、可靠,但要等到后代出生后才能得出评价结果,鉴定周期太长,不利于分离方法的优化研究,同时非预期性别后代的出生要消耗很多的人力、物力、财力。

二、胚胎性别鉴定评价法

胚胎性别鉴定评价法准确率较高,方法也很成熟,很多试验采用这种方法对分离精液进行评价分析。主要有胚胎细胞学检测评价法、胚胎免疫学评价法(H-Y抗原评价法)、胚胎分子生物学评价法。

胚胎细胞学检测评价法的基础是核型分析,其原理是在胚胎滋养层上取部分细胞,用秋水仙素处理,使有丝分裂停留在中期,再固定染色,在显微镜下检查其核型,并根据Y染色体的有无判定胚胎性别,然后统计所检胚胎的性别,对精子分离的准确率进行评价分析,准确率可达100%。

胚胎免疫学评价法(H-Y抗原评价法)是利用H-Y抗血清或H-Y单克隆抗体与胚胎细胞进行免疫反应,从而进行胚胎性别鉴定,并根据胚胎性别统计结果,对精子分离效果进行评价。主要有间接荧光免疫法和囊胚形成抑制法两种。

胚胎分子生物学评价法是根据对胚胎细胞Y染色体上的SRY(Sexdetermining region of the Y-chromosome)等性别特异基因的检测来对分离精子进行评价的方法,检测到特异信号的判定为雄性,未检测到特异信号的判定为雌性。这种方法具有灵敏、准确、快速等特点,主要有胚胎细胞荧光原位杂交法和PCR胚胎性别鉴定法。

上述胚胎性别鉴定评价法都需要将胚胎抽出体外进行检测,并需要在胚胎上切取部分细胞进行鉴定,对胚胎有一定损伤。同出生性别鉴定法相比,胚胎性别鉴定评价法鉴定所需周期大大缩短,但过程耗时也较长,而且胚胎离体操作也给体内胚胎的生存带来一定风险。

三、流式细胞仪重分析评价法

将分离后的精子先超声断尾,仅留下精子头部,以增加精子的定向效应;然后用荧光染料Hoechst33342进行染色体染色,使染料定量地与DNA重新结合,精子以100~200个/s的速度通过流式细胞仪进行重分离和分析。流式细胞仪重分析评价法具有高效、准确、可靠和快速等特点。

四、荧光原位杂交评价法(FISH评价法)

FISH是在细胞遗传学、分子遗传学和免疫学相结合的基础上发展起来的一种检测技术。其原理是利用碱基互补性,将标记上荧光素等非放射性荧光物质的染色体特异核酸探针与细胞核中的染色体序列杂交,在荧光显微镜下直接观察并区分X、Y精子,它不仅可用于分裂中期的细胞,还可用于分裂间期。其特点在于能快速、准确检测大量精子。

五、PCR评价法

利用PCR扩增技术可在短时间内将目标DNA片段大量富集,极微量的性别特异信号在短时间得到无限放大,扩增产物通过凝胶电泳及染色分析,就可判断所检测精子的性别,通过统计检测结果对分离精子纯度做出最终评价。

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