流式细胞仪分选法分离人类X和Y精子

待分选的精子被制备成单个细胞的悬液,经特异性的活体荧光染料染色后放入样品管中,在气体的压力下进入流动室,在充满于流动室中的鞘液约束下,细胞排成单列形成液柱;在由喷嘴喷出时,流动室产生频率为30kHz的机械振动,使液柱断裂成一连串均匀液滴流出,如果液滴中精子特性符合分选特性,则仪器在这个被选定的精子刚形成液滴时充以指定电荷,带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时,依所带电荷向左或右偏转,进入指定的收集器内,完成精子分选。

试剂与器材:

  1. Tyrode液;
  2. 10mmol/L PBS;
  3. HO33342(Hoechst33342,DNA特异性的活体荧光染料);
  4. 2ml聚丙烯试管;
  5. 14ml离心管;
  6. Epics 753或Epics V型流式细胞仪分选器:专门改进用于精子分选,其前向角散射光检测器被荧光检测器所取代,标准的圆柱状标本注射尖嘴被改制成斜面以产生带状标本细流。

方法:

  1. 新鲜液化精液用等量PBS稀释后,取3.0ml左右加入到含有0.25mol/L蔗糖的10mmol/L TrisHCl液(pH7.4)作缓冲的离心管中,室温下400g离心10min,去上清液,并用棉拭子擦去试管壁上黏附的精浆,剩下的精子沉淀用9ml PBS混悬,同上离心后去上清液,最后沉淀用PBS混悬并调精子浓度为20×106/ml;
  2. 上述精子悬液用10μmol/L HO33342在35℃条件下孵育1h,使其染上活体荧光染料;
  3. 将已染色的精子悬液加入样品管中,以PBS作为鞘液,紫外光(351nm,364nm)作为激发光,通过流式细胞分选器将X和Y精子收集到两个单独的无菌的2ml聚丙烯试管中。

分离效果:Johnson等采用该法分离牛、羊、猪和兔的精子,前三种动物X和Y精子纯度高达90%以上,兔的X和Y精子纯度分别为86%和81%,Johnson等随后又采用该法分离了人的精子,其X和Y精子的纯度分别达到80%和75%以上,并且分选后的精子1h后的活率范围仍为65%~75%,说明人精子没有因染色和细胞分选而出现明显的伤害。目前采用该法分离的牛和兔等动物精子进行人工受精已获成功,并生产出正常后代。

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