密度梯度离心法分离 人类X和Y精子

原理:X、Y精子尽管由平衡沉淀作用获得的密度是相似的,但在分离介质中的沉降速度不等,X精子沉降速度比Y精子快;这样在一个由低到高的密度梯度中,通过适当的离心力作用下,经过一定时间离心,可在不同密度梯度中分离出富含X或Y精子的标本。

试剂与器材:Earle培养液、Percoll液、Nycoprep(密度为1.15g/L,渗透压为290mOsm/kg)、14ml离心管。

方法:100%Percoll液制备:9份Percoll+1份Earle液+100IU/ml青霉素+1.89g/L,密度为1.11g/ml,渗透压280mOsm/kg。在使用前一天,将100%Percoll液放在5%培养箱中平衡8~10min,贮存于4℃冰箱;在使用当天,将100%Percoll液1000g离心10min,以沉淀任何二氧化硅颗粒凝集物。然后用Earle液将100%Percoll液稀释成各种所需浓度。

  1. 8层Percoll梯度离心法:在14ml离心管中,由下至上从84%到35%Percoll液,按7%递减,各加1.0ml,形成7层Percoll梯度;取1.0ml液化精液加入Percoll梯度的最上层,250g离心30min,移去各层液体,沉淀层用Earle液(含10%胎儿脐带血清)洗涤,300g离心,去上清液,最后沉淀用适量Earle液悬浮。
  2. 8层Percoll+Nycoprep分离法:在一支14ml离心管中先加入1.0ml Nycoprep液,然后在其上层依次加入各1.0ml的按10%递减的100%~40%Percoll液共7层,最后,最上层再加入1.0ml的液化精液,250g离心25min,移去各层液体,沉淀用1~2ml Earle液洗涤,离心,去上清液,沉淀再用适量Earle液悬浮。
  3. 12层Percoll梯度离心法:在14ml离心管中,由下至上各加0.7ml,按5%递减的80%~30% Percoll液共11层;取2.0ml液化精液放至4.0ml 25%Percoll层上,250g离心20min,沉淀的精子用0.7ml 25%Percoll悬浮,放到上述Percoll层上,250g离心30min,移去各层液体,沉淀用培养液洗涤、离心后,去上清液,沉淀再用适量培养液悬浮。

结果与讨论:Percoll为二氧化硅的衍生物,可被制备成等渗的不同密度梯度,其低黏稠度(10±5CP)使其能够在低速离心下即可获得平衡沉淀。Kaneko等采用8层Percoll梯度离心法,在精液层与Percoll层交界处收集的精子中Y精子为73.1%,而在沉淀层中Y精子仅为27.4%;随着Percoll液的密度增加,X精子增加了4.4倍,而Y精子仅下降了1.6倍,表明该法更适合X精子的分离;Iizuka等采用8层Percoll梯度离心法在沉淀中获得82%X精子,而采用12层Percoll梯度离心法于沉淀层中获得94%X精子;Andersen等采用8层Percoll+Nycoprep分离法于沉淀层中检出Y精子为39.3%,认为该法是目前最有效的减少Y精子的方法。虽然通过Percoll梯度离心后产生的精子数量明显低于原精液,但一般整份精液处理后精子仍可达500万到1000万,完全可以用于人工授精或IVF-ET等操作。

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