体外受精

体外受精技术最初是在小鼠、金黄地鼠和其他动物试验中进行的,目的是为了了解受精的过程和胚胎的形成。在人类IVF成功之前,已对精子获能的要求、精卵间相互作用等有较完整而清晰的了解。有幸的是供体外受精的人精子的制备难度低于已研究过的其他动物的精子制备。人精子在除去精浆成分后自动获能,在受精前不需预培养。在受精3h内,在卵母细胞胞质内可发现精子。当卵母细胞放入培养箱中培养后,即刻要求男方(IVF患者的丈夫)通过手淫采精。一般男方禁欲2~7d,将排出的精液射入到一无菌洁净的玻璃容器内,置37℃、5%CO2培养箱内,待精液液化后进一步处理。

精子体外获能与处理

正常精液多半在30min内液化,对液化后的精液进行常规分析,包括精子浓度、活力、前向运动能力、精子的形态、红细胞和白细胞,精子凝集状况。

精液洗涤最常用的有两种方法:

标准上游法

取已消毒好的离心管,用Pasteur吸管取液化后的精液与精子洗涤液按1∶2的比例分别加入到离心管中,充分混匀,除去精液中的块状物和杂质,300g离心10min;弃上清液,保留离心管底层形成的乳白色沉淀块,注意在吸取上清液时不要触及沉淀块,再次加入精子洗涤液2ml,轻轻混匀,300g离心10min;小心弃去上清液,再徐徐加入1ml精子洗涤液。注意不要触及沉淀,同时也不要混匀,用塞子或试管帽松松盖上离心管,使气体能够进入。然后将离心管倾斜45°,上游1h;1h后精子沉淀块中的一些有活力的精子离开沉淀团块,游至液体的上层,这些精子就是体外受精所需要的精子,另取一支消毒洁净的试管,轻轻收集上层云雾状、活力强的精子约0.6ml,调整精子浓度1×106/ml~3×106/ml。

Percoll梯度离心法

Percoll是一种用聚乙烯吡咯烷酮包被硅体胶形成的介质,异常和正常活动的精子可以通过非连续或连续Percoll梯度离心来进行分离。具体方法如下:取无菌离心管一支,分别先后加入90%和45%的Percoll各2ml,然后再加入2ml液化精液于45%Percoll之上,注意每次都轻轻加入,每层之间界面要清楚;平衡后放入离心机内,300g,离心20min;弃上清液,用Pasteur吸管取出底部精子,移入另一支无菌离心试管内,与精子洗涤液2~3ml混匀,200g离心5min;可重复上一步再洗一次,以充分去除残留的Percoll,然后将精子沉淀物转移至干净离心管,小心加入少量培养液,置37℃、5%CO2培养箱内备用。Percoll密度梯度离心法适用于正常的精液标本及少弱精子症的精液标本,能大大提高精子的回收率。但当精子浓度过低或活力很低时,需用微量Percoll密度梯度法,以增加活动精子的洗出率。

目前,由于Percoll可能的毒性作用,国内外的IVF中心已基本不用Percoll处理精液,替代的是PureSperm。PureSperm是一种用HEPES缓冲的亲水性硅烷包裹的氧化硅胶体溶液,毒性低,其使用方法及效果与Percoll相似。

体外受精步骤

在体外受精前,必须先调节受精液滴中精子的浓度。有关受精时加入活动精子数目的多少各IVF中心有较大差异,一般认为加入精子的数目是20 000~100 000个/ml。增加精子的浓度,可能会增加多精受精率。若每ml少于10 000个有活力的精子,有可能降低正常体外受精率。

卵母细胞经体外培养4~6h后即可进行体外受精。受精的方式有两种,一种是微滴法,每个液滴中放一个卵子;另一种用四孔皿进行,每孔放2~3个卵子。常规体外受精的时间为精子与卵子共同过夜培养16~20h。然而有研究表明,长时间的精卵共培养并不能提高正常受精率,相反如果精卵共培养时间长,精子及颗粒细胞可产生大量的氧化物质影响胚胎的质量,同时长时间的共培养又会消耗大量的营养物质,导致受精卵的能量不足,影响胚胎的质量。因此,目前很多IVF中心采取3~4h的短时间体外受精的方式,并不影响受精率。

分离颗粒细胞及换液

在常规体外受精16~20h或短时间体外受精3~4h后,将卵母细胞周围的颗粒细胞与之分开和转移受精卵显得十分重要。前者可在卵母细胞内发现原核,即卵母细胞内出现两个圆形结构,约1.5~2.0μm,且光洁、致密,提示已受精,这就是雌、雄原核。而后者则是通过第二极体的观察来判断受精的情况。此时需要将受精卵转移到预先准备好的胚胎培养液中,使其继续发育。从卵细胞周围分离颗粒细胞的方法主要有两种,一种是用两只注射针头,在解剖显微镜下轻轻将卵母细胞周围残留的颗粒细胞剥离;另一种方法是用微吸管法,其内径比卵母细胞约大一点,反复吹吸几次,同样也能使卵母细胞周围的颗粒细胞脱落。每个IVF中心有自己惯用的分离方法,但无论用哪种方法,原则是不可伤及卵母细胞和透明带。

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