人精子染色体标本的制备

人精子为高度分化的细胞,很难在体外直接制备染色体。应用体外获能的人精子,可以穿透去透明带的金黄地鼠卵,形成含有人类和地鼠染色体组的杂交受精卵,受精卵在体外培养进行有丝分裂。用长春新碱或鬼臼毒素阻止纺锤丝微管的形成,可使受精卵停留在有丝分裂中期,通过分化染色,可以观察人精子的单倍染色体。

试剂及器材

一、器材:超净工作台、恒温培养箱、二氧化碳培养箱、普通显微镜、倒置显微镜、解剖显微镜、分析天平、离心机、解剖剪、解剖镊、解剖针、吸管、凹玻板、试管、离心管、平皿、注射器(0.25ml、1ml、5ml、20ml)及针头等。

二、试验材料:人精液、雌性金黄地鼠。

三、试剂及配制:BWW培养液、卵培养液、精子获能液、精子洗涤液、人血清白蛋白、10μmol/L ionephore液、30IU/ml孕马血清促性腺激素、30IU/ml绒毛膜促性腺激素、1%透明质酸酶、灭菌石蜡油、0.06mol/L KCl溶液、固定液A、固定液B、固定液C。

BWW培养液 成分浓度(g/L)

NaCl 5.54

KCl 0.356

KH2PO40.162

MgSO4•H2O 0.294

葡萄糖0.1

NaHCO32.10

丙酮酸钠0.028

乳酸钠9.7

CaCl2•2H2O 0.25

庆大霉素0.05

0.4%酚红1ml

精子获能液:实验当天,取BWW培养液0.5ml,加入血清白蛋白17.5mg。

BWW精子洗涤液:实验当天,取BWW培养液70ml,加入人血清白蛋白210mg。

卵培养液 成分与浓度(g/L)

CaCl2•2H2O 0.132

KCl 0.200

KH2PO40.200

MgCl2•6H2O 0.100

NaCl 8.00

NaH2PO41.15

牛血清白蛋白4.00

葡萄糖1.00

丙酮酸钠0.036

卡那霉素0.025

酚红0.005

实验内容和方法

一、金黄地鼠超排卵

选择动情周期第一天的雌鼠(手指轻压鼠腹部,阴道有淡黄色或白色分泌物),肌肉注射孕马血清促性腺激素(60IU/只),56h后注射绒毛膜促性腺激素(45IU/只),72h后用于取卵。

二、获能液滴和受精液滴制备

在实验当天于小平皿内取0.05ml精子获能液制备获能液滴。另取BWW精子洗涤液0.1ml,在获能液滴旁制备2个受精液滴,覆盖石蜡油。

三、人精子标本制备

供精者手淫法取精液,37℃液化30min。将液化精液均量加入分别盛有2ml精子洗涤液的10支小试管底部,放入二氧化碳培养箱1h。收集上层高活力精子,2000r/min离心8min,去上清液。加入精子洗涤液洗涤1次,离心后用10mol/L ionephore液处理5~10min,其间在倒置显微镜下观察,当精子有20%左右停止运动时中止处理,精子洗涤液洗涤,离心,去除上清液。加入精子获能液少许,制成精子悬液。用毛细吸管吸取精子悬液,加入平皿中获能液滴内,镜下观察,精子密度很大,以尾部能摆动为宜。置二氧化碳培养箱中4h,让其充分获能。

四、鼠卵标本制备

颈椎脱臼法处死金黄地鼠,取出输卵管于精子洗涤液中,在实体解剖镜下用解剖针破输卵管腹壶膨大部,挤压出云雾状卵丘。将卵丘散开。用洗涤液洗涤2次后,吸入盛有0.1%胰酶液的凹玻板内,镜下观察,透明带消失或卵变扁而又复圆时,将卵吸至洗涤液中洗涤两次。

五、受精

在解剖镜下,用微细管将卵吸至1个受精液滴内,使卵在液滴内均匀分布。从获能液滴的上层以高活力精子注入含卵受精液滴,其密度约为每卵周围20~30个精子游动,放入二氧化碳培养箱。间隔2~3min观察1次卵表面精子数目,当大多数卵表面附着15~20个精子时,将卵移至另1个受精液滴内,继续孵育30min。

六、受精后培养

受精处理的卵细胞用精子洗涤液洗涤2次,分散移入预温37℃的卵培养液内,二氧化碳培养箱内继续培养6h,加入长春新碱或鬼臼毒素,最终浓度各为0.05g/ml,再培养11h。

七、染色体制片

将培养后的卵移入预温37℃的0.06mol/L KCl溶液中低渗处理30min。每次将4~6个低渗后的卵移至固定液A中,马上覆盖少许低渗液。约4~6min,卵体积增大,颜色由棕褐色变白,开始浮动,立即用吸管吸出,在载玻片上铺开,吸取固定液B少许,吸管端部接近卵,使固定液B的挥发气体作用于卵30s,将固定液B轻轻吸出。5min后,将玻片轻轻放入固定液C,1min后缓慢取出(约用40s),4%Giemsa液染色30min,镜检。

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