精子的病理学检查方法和注意事项

常规染色精液样本的制备

用洁净刻度量杯手淫或体外排精方法,必须禁欲3~5d,取全部精液置入量杯中,37℃水浴完全液化后,将精液以玻璃吸管(约50μl)均匀涂布于载玻片上,风干,以甲醛-钙固定液固定3~5min,自然干燥。按染色程序进行操作,置显微镜下计数正常精子百分率、畸形精子百分率、每类畸形精子的百分率。

常规透射电镜精液样本的制备

用洁净刻度量杯(不超过10ml容积),手淫法收集禁欲3~5d的全部精液标本,置37℃水浴锅中,待其完全液化,以玻璃吸管将精液移至离心管中,2000~2500r/min离心3~5min;弃上清液,补充同体积精子营养液(如3.5ml精液,经离心后,弃上清液2.5ml,加精子营养液2.5ml),2000~2500r/min离心3~5min,吸入沉淀的精子团块(像棉花团一样),在盛有新鲜固定液的固定瓶固定(固定液的体积必须大于精液团块的25~50倍)静置,室温(18~22℃)或4℃冰箱过夜。固定好的标本以无齿眼科镊取出,最好放入盛有0.1mol/L TBS缓冲液(PH7.2~7.4)中清洗3次,每次2~3min,1%四氧化锇中固定2h,上升梯度乙醇脱水(其中在100%乙醇中脱水的时间为20~30min,2次),100%丙酮→环氧丙烷(2次,每次15min)→环氧丙烷:包埋剂=1∶1 (1~2小时)→包埋剂(几小时)→包埋。

普通透射电镜标本的固定剂一定要考虑实验的目的和以后的用途,一般以3%多聚甲醛或0.5%戊二醛较好,戊二醛的渗透能力强,但膜性结构保存较差,多聚甲醛的渗透力不如戊二醛,但对膜性结构有很好的保存作用。

包埋剂,常用有两种主料,一种是Epon812,一种是环氧树脂618。前者是一种进口的环氧树脂,它的黏度较低,而国产环氧树脂618为一种淡黄色或淡琥珀色的黏稠性液体,黏度较大,我国长江以南还是以环氧树脂618为好,长江以北以Epon812为好。

普通扫描电镜标本的制备

用洁净的玻璃刻度量杯(容积在10ml)采取禁欲3~5d的全部精液标本,以玻璃吸管吸取精液1ml左右,滴在干净的支持物上,5%苏打水清洗,2.5%戊二醛+1%四氧化锇固定(多用快速冷冻固定),用上升梯度乙醇脱水,标本入醋酸异戊酯中,真空中临界点干燥,离子溅射镀膜,组织导电以常规法进行,脱水和干燥按常规手法进行,必须在一周内扫描电镜观察。

扫描免疫电镜技术标本的制备

  1. 制成细胞悬液:用10ml内含1mg/ml牛血清白蛋白的清洗缓冲液(WBS-BSA)悬浮精子,250g离心5min,重复清洗1次,加入WBS-BSA至精子浓度为105~106/ml,震摇成单细胞悬液。
  2. 细胞附着于固体支持物:将 聚-L-赖氨酸(100μg/ml)滴在用乙醇清洗过的盖玻片上,经4℃放置30min。倒去液体,用双蒸水彻底清洗,空气干燥。将精子滴在盖玻片上。
  3. 前固定:固定前用WBS-BSA洗,每次5min;2%多聚甲醛+0.5%戊二醛固定10~60min;WBSBSA清洗3次,每次5~15min;加含0.1~0.5mol/L氯化铵的PBS,30~60min;
  4. 免疫标记:加入适当稀释好的一抗,置冰箱内24h,PBS清洗3~4次;加入适当稀释好的胶体金二抗(1∶30~1∶100),淡红色为适宜稀释液,室温10~60min;双蒸水清洗3次,每次3min;5%醋酸双氧铀5min;双蒸水清洗;柠檬酸铅5min;双蒸水清洗;
  5. 扫描电镜观察。

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