流式细胞仪在精子研究中的应用

流式细胞术(flow cytometry,FCM)是20世纪70年代发展起来的一种可以对细胞或亚细胞结构进行快速测量的新型分析技术和分选技术。其特点是测量速度快,最快可在1秒钟内计测数万个细胞;可进行多参数测量,可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量,并具有明显的统计学意义;是一门综合性的高科技方法,它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果;既是细胞分析技术,又是精确的分选技术。与传统的荧光镜检查相比,具有速度快、精度高、准确性好等优点,成为当代最先进的细胞定量分析技术。

流式细胞术

一、流式细胞术基本原理

待测细胞被制备成单细胞悬液,经特异性荧光染料染色后置于专用样品管中,在气体压力推动下被压入流动室,流动室内充满鞘液(不含细胞或微粒的缓冲液),在高压作用下从鞘液管喷出包裹细胞,使细胞排成单列形成细胞液柱,依次通过检测区。液柱与高度聚焦的激光束垂直相交,被荧光染料染色的细胞受到激光激发产生荧光信号和散射光信号,这些光信号通过波长选择的滤光片,由相应的光电管和电子检测器接收并转换成电信号,经放大器放大后送入计算机并进行分析显示和结果输出。

带有细胞分选功能的流式细胞仪对细胞的分选是由分选器来完成。待分选的细胞在形成液滴时被充以特定的电荷,并通过超高频的压电晶体产生高频振荡,使液柱断裂成均匀的液滴,带有电荷的液滴向下落入偏转板的高压静电场时,按照所带电荷发生偏转,落入指定的收集器内,完成分类收集的目的。

二、流式细胞仪的基本结构

流式细胞仪是由流动室和液流系统、激光源和光学系统、光电管和检测系统、计算机和分析系统四大部分组成。

三、流动室和液流系统

流动室由样品管、鞘液管和喷嘴等组成,常用光学玻璃、石英等透明、稳定的材料制作。设计和制作均很精细,是液流系统的心脏。样品管贮放样品,单个细胞悬液在液流压力作用下从样品管射出;鞘液由鞘液管从四周流向喷孔,包围在样品外周后从喷嘴射出。

四、激光源和光学系统

经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。常用的光源有弧光灯和激光;激光器又以氩离子激光器为普遍,也有氪离子激光器或染料激光器。光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。

五、光电管和检测系统

经荧光染色的细胞受合适的光激发后所产生的荧光是通过光电转换器转变成电信号而进行测量的。光电倍增管(photomultiplier tube,PMT)最为常用。PMT的响应时间短,仅为ns数量级;光谱响应特性好,在200~900nm的光谱区,光量子产额都比较高。从PMT输出的电信号仍然较弱,需要经过放大后才能输入分析仪器。流式细胞计中一般备有两类放大器:一类是输出信号辐度与输入信号成线性关系,称为线性放大器(linear amplifier)。线性放大器适用于在较小范围内变化的信号以及代表生物学线性过程的信号,例DNA测量等。另一类是对数放大器(logarithmic amplifier),输出信号和输入信号之间呈常用对数关系。

六、计算机和分析系统

经放大后的电信号被送往计算机分析器。多道的道数是和电信号的脉冲高度相对应的,也和光信号的强弱相关。对应道数的纵坐标通常代表发出该信号的细胞相对数目。多道分析器出来的信号再经模-数转换器输往计算机处理器编成数据文件,或存贮于计算机的硬盘和软盘上,或存于仪器内以备调用。计算机的存贮容量较大,可存贮同一细胞的6~8个参数。存贮于计算机内的数据可以在实测后脱机重现,进行数据处理和分析,最后给出结果。除上述四个主要部分外,还需备有电源及压缩气体等附加装置。

流式细胞术检验样本的制备及保存

流式细胞术的实验对象是单个细胞悬液,如睾丸组织必须分散为单个细胞,精液单层细胞也要分散为单个细胞。

一、培养细胞的制备

  1. 培养细胞用0.25%的胰酶消化。
  2. PBS或生理盐水洗涤细胞2次,再用PBS或生理盐水悬浮细胞,加入预冷的无水乙醇,终浓度为60%~70%,快速混匀,并用封口膜封口,置4℃下可保存15天左右。

二、新鲜标本的制备

  1. 将标本切成1~2mm3的小块。
  2. PBS或生理盐水清洗后去除上清,加入0.2%胶原酶(或0.15%胰蛋白酶)37℃消化10~30分钟(根据实验及不同组织确定),并不断振动。
  3. 300目尼龙筛过滤,除去组织团块,PBS洗涤2次,300g离心5分钟,获得已消化的细胞。

三、石蜡包埋标本的制备

  1. 标本在切片机上切取3~5片50μm厚的组织片。
  2. 将切片彻底脱蜡,梯度乙醇(100%、95%、70%)及蒸馏水水化。
  3. 0.5%胃蛋白酶(或胰蛋白酶)37℃消化30分钟,每隔10分钟振动1次。
  4. 300目尼龙筛过滤,获得的细胞悬液PBS洗涤2次,300g离心5分钟。

四、直接免疫荧光标记的样品制备

用标有荧光素的特异抗体对细胞进行直接染色,然后用流式细胞仪检测,阳性者即表示有相应抗原存在。实验步骤如下:

  1. 每份取100μl单细胞悬液(细胞密度约1×106个细胞)。
  2. 一份加入相应量的FITC或PE标记的特异性荧光直标单抗,另一份加入荧光标记的无关单抗,作为同型对照样品。
  3. 室温下避光反应一定时间(时间长短根据试剂说明书要求进行),一般在室温下反应15~30分钟即可。
  4. 加入500μl PBS重新制成单细胞悬液即可上机检测。

五、间接免疫荧光标记的样品制备

  1. 取1×106个细胞/100μl,先加入一抗混匀,置室温下避光反应30分钟。
  2. 用PBS洗涤细胞2次,离心沉淀弃掉上清液(离心转数一般为800~1000rpm,5分钟)。
  3. 用100μl PBS重新制备细胞悬液,再加入FITC或PE标记荧光二抗(用量均按说明书要求加入)混匀,室温下反应30分钟。
  4. 用PBS再洗涤细胞2次,加入500μl PBS重新制成单细胞悬液,上机检测。
  5. 制备好的样品,若不能及时上机检测,用1%~4%的多聚甲醛固定,4℃下可保存5天。

六、DNA荧光染色的样品制备

DNA是细胞内含量比较恒定的参量,随着细胞增殖周期的各时相而发生变化。荧光染料(如PI)可选择性地定量嵌入核酸(DNA/RNA)的双螺旋碱基之间,与细胞特异性结合,DNA含量与荧光染料的结合量成正比,因此通过测定荧光强度可获知细胞的增殖情况。

  1. 将固定过的细胞离心(500~1000rpm,5分钟)。弃上清液,再用PBS洗涤2次。
  2. 用PBS调整细胞浓度,每份为1×106个细胞/100μl。
  3. 加入1000μl DNA荧光染料,室温下避光染色15分钟。
  4. 上流式细胞仪检测。

流式细胞术在精子研究中的应用

一、精子染色质结构分析

精子染色质结构分析(sperm chromatin structure assay,SCSA)利用吖啶橙的异染性与专用软件计算机界面的流式细胞仪相结合,快速识别带有不正常染色质结构的精子。SCSA参数在预测体外受精(IVF)卵胞浆内精子注射(ICSI)等辅助生殖技术的成败,比较密度梯度离心法、上游法、玻璃毛过滤及冷冻保存对精子DNA完整性的影响以及癌症患者治疗前、后生殖功能的评价方面发挥重要作用。

二、精子顶体结构检测

流式细胞仪与人精子顶体特异性标志物-结合异硫氰酸荧光素的花生凝集检测精子顶体的完整性。人精子顶体结构的完整性与精子的存活率、前向运动百分率、精子正常形态百分率呈正相关,正常生育组顶体完整率及发生精子顶体反应百分率显著高于不育组,精子顶体完整率与发生精子顶体反应百分率呈正相关。可作为评价人精子授精能力的有效指标之一。

三、精液细胞成分DNA的变化

采用流式细胞仪(FCM)、激光共聚焦显微镜(CLSM)和常规精液检查法对不育症患者进行精液细胞DNA分析。研究表明,精液细胞成分等有多种变化:①亚单倍体细胞碎片和凋亡细胞增多;②单倍体的成熟精子数量减少;③单倍体圆形精子细胞增多;④畸形精子增多,精子DNA含量和密度异常;⑤≥2倍体的细胞(白细胞、G1期精原细胞、精母细胞、上皮细胞及4倍体细胞等)增多。

四、精子染色体核型分析

定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞;分析生物大分子,如DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系,进行染色体核型分析,并可纯化X或Y染色体。

五、在辅助生殖技术中的应用

辅助生殖技术中,X、Y精子分离技术可以用于预防性连锁遗传疾病。而精子的检测则可以明确不孕症的诊断,预测精子的受精能力,为选择正确的助孕方法提供依据。因而使用流式细胞仪分离和检测人精子有重要的意义。

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