基因芯片技术在精子研究中的应用

基因芯片技术是伴随人类基因组计划的实施而发展起来的一门新兴技术,该技术将成千上万个DNA或寡核苷酸片段固定在玻璃、尼龙膜或硅片等载体上,与标记的样品探针杂交,分析样品中基因表达、基因序列、基因突变和多态性变化等情况,这是一个高效率和大规模的基因组分析和基因表达的研究技术。1998年底,美国科学促进会将基因芯片技术列为1998年度自然科学领域十大进展之一,足见其在科学史上的意义。现在,基因芯片这一新技术已被应用到生物科学众多领域之中。

基因芯片技术的基本原理

基因芯片(gene chip,DNA chip),又称DNA微阵列(DNA microrray),是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵阵列。在一定条件下,载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行标记,在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。

基因芯片主要组成

目前,基因芯片主要由寡核苷酸芯片和cDNA芯片两大类组成。

寡核苷酸芯片(oligonucleotides chip):是指在固相载体上的寡核苷酸微阵列。其制备方法以直接在基片上进行原位合成为主、有时也可以预先合成,再按照制备cDNA芯片的方法固定在基片上。原位合成(in situ synthesis)是目前制造高密度寡核苷酸芯片最为成功的方法。

cDNA芯片(cDNA chip):在玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等固相载体上固定的成千上万个cDNA分子组成cD4A微阵列。制作cDNA芯片最常用的固相载体是显微镜载玻片,载玻片在使用前需要进行表面处理,目的是抑制玻璃片表面对核酸分子的非特异性吸附作用。常用的表面处理方法有氨基化法、醛基化法和多聚赖氨酸包被法。cDNA芯片的制备:制备cDNA芯片多用合成后点样法(spotting after synthesis),简称点样法。片数目共同决定了点样所需时间;针头的直径和形状、样品溶液的黏滞程度以及固相载体的表面特性决定了芯片上液滴的量和扩散面积。除点样法以外,cDNA芯片也可以用电子定位法(electronic addressing)制备。

基本步骤

基因芯片技术主要包括四个主要步骤:①芯片制备;②样品制备;③杂交反应;④信号检测和结果分析。

  1. 芯片制备:目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体,采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外,还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。
  2. 样品制备:生物样品往往是复杂的生物分子混合体,除少数特殊样品外,一般不能直接与芯片反应,有时样品的量很小。所以,必须将样品进行提取、扩增,获取其中的蛋白质或DNA、RNA,然后用荧光标记,以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。
  3. 杂交反应(hybridization reaction):是荧光标记的样品与芯片上的探针进行反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中,减少生物分子之间的错配率。
  4. 信号检测和结果分析:杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像,将荧光转换成数据,即可以获得有关生物信息。

基因芯片技术在精子研究中的应用

精子相关基因中的研究

Meng等用基因芯片对小鼠睾丸研究发现:在小鼠睾丸Sertoli细胞中雄激素受体的减少可以导致输精管道紧密连接蛋白claudin 3表达下降,从而导致血-睾屏障对生物素的通透性增加。通过此研究,他认为雄激素对精子生成的影响可是通过生精管道上微环境变化引起的。Hu等在采用人类cDNA芯片在人类胎盘、成人睾丸和人类精子对nDnaJAI基因做了研究。结果表明:nDnaJAI基因在成人睾丸中的表达强度几乎是胎盘中的3倍。因为nDnaJAI基因家族可以在精子中表达,所以推测DnaJAI和nDnaJAI家族在睾丸发育和精子成熟中起着重要的作用。

精子RNA与男性生殖的相关性研究

Huang等用人精子cDNA探针与人睾丸cDNA芯片杂交,研究了精子RNA选择性剪切与精子发生之间的关系;毛向明等应用基因芯片技术研究了成年男性精子与淋巴细胞间的基因表达差异;Ostermeier等用含有近30 000个Tag的人cDNA芯片与精子cDNA杂交,得到了近2780个ESTS;Burczynski等认为人精子中近3000个转录模板既包含了精子发生期间的各种遗传信息,又蕴涵着精子的受精能力、受精卵的发育和胚胎发育等遗传信息。因此精子RNA可以作为一个衡量精子质量、预测精子受精能力的重要指标。

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