聚合酶链式反应在精子研究中的应用

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)自1983年发明至今,虽然只有30多年的时间,但其在检测中的应用极为广泛,随着PCR技术的不断进步,也促使男科学的研究得到了飞速的发展。

聚合酶链式反应及其派生技术

聚合酶链反应技术

一、聚合酶链反应的基本原理

是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片段高效扩增的技术,可检出微量靶序列。主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成:即在高温(95℃)下,待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板;而后在低温(37~55℃)情况下,两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合,形成部分双链;在Taq酶的最适温度(72℃)下,以引物3'端为合成的起点,以单核苷酸为原料,沿模板以5'→3'方向延伸,合成DNA新链。这样,每一双链的DNA模板,经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行,每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板,每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增1倍,PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增,经过25~30个循环后,理论上可使基因扩增109倍以上,实际上一般可达106~107倍。

二、样本制备

(1) 精子DNA的制备:真核细胞DNA由细胞核DNA和线粒体DNA组成。细胞核DNA与蛋白质结合构成染色体,它包含了人类几乎全部的遗传性息。线粒体DNA存在于细胞质线粒体内,呈高度扭曲的双股闭环结构,几乎不受DNA结合蛋白的保护。精子DNA制备时往往同时将细胞核DNA和线粒体DNA一起提取。

精液:①新鲜精液完全液化4℃存放,取0.5ml 加10mlPBS洗涤2次,离心收集精子细胞。②加2ml STE液悬浮精子细胞,加SDS(终浓度为2%)、蛋白酶K(终浓度为0.2mg/ml)、DTT(终浓度为40mmol/L),彻底混匀,55℃水浴4~5小时,37℃过夜。其他步骤同白细胞提取方法。

(2) 睾丸组织RNA的制备:获得睾丸组织或生殖细胞总RNA是开展相关研究的关键,实验室环境中广泛存在RNA酶,这些酶通常非常稳定,因而必须在特定的能使RNA酶变性的条件下裂解细胞,进而将RNA与其他细胞大分子分离,睾丸组织RNA的提取通常采用异硫氰酸胍酸酚法进行制备:

  1. 2g睾丸组织加液氮磨成粉后,加10ml变性溶液(4mol/L异硫氰酸胍,25mmol/L枸橼酸钠(pH 7.0),0.5%十二烷基-N-甲基甘氨酸钠,0.1mol/L β-巯基乙醇),匀浆2分钟。
  2. 移入50ml塑料离心管,加2mol/L醋酸钠1ml(pH4.0),10ml水饱和酚及2ml氯仿异戊醇混合液(24∶1)。
  3. 剧烈振荡悬液1分钟,冰浴30分钟,10 000r/min 4℃离心20分钟。
  4. 移水相入新管,加入5ml水饱和酚,5ml氯仿异戊醇混合液,混匀,10 000r/min 4℃离心20分钟。
  5. 移水相入新管,加10ml氯仿异戊醇抽提1次,10 000r/min 4℃离心20分钟。
  6. 移水相入新管,加3倍体积无水乙醇和3mol/L醋酸钠(pH 6.0)1ml混匀,置-20℃过夜。
  7. 10 000r/min 4℃离心20分钟。弃上清。70%乙醇稍洗,超净室吹干后溶于50µl水中,-70℃保存备用。

三、聚合酶链式反应的基本操作

  1. 在0.2ml薄壁反应管或0.5ml Eppendorf管中依次加入下列试剂:①10×PCR反应缓冲液3μl;②MgCl2(25mmol/L)2.4μl;③dNTPs(20mmol/L混合母液)0.3μl;④引物l(20mmol/L)0.3μl;⑤引物2(20mmol/L)0.3μl;⑥模板DNA(50ng-1μg/μl)2μl;⑦TaqDNA聚合酶(5u/μl)0.15μl;⑧无菌水加至30μl。上述液体混匀后,瞬间离心。
  2. 将反应管置于PCR仪上进行反应,反应条件为:①94℃预变性5分钟;②94℃变性30秒;③52℃退火75秒;④73℃延伸60秒。共30个循环。
  3. 末次循环后,73℃再延伸7分钟。
  4. 反应结束后,取部分DNA扩增产物进行分析,其余置于4℃保存备用。

四、聚合酶链式反应扩增产物的电泳分析

琼脂糖凝胶电泳:琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段,其分离范围较广泛,用于分离200bp~50kb的DNA片段,不同浓度的琼脂糖凝胶有不同大小的孔径,为使迁移率和分子的大小成正比,以便凝胶电泳能比较准确地测出分子量并进行比较,应根据需要选择不同浓度的凝胶,分子量越大选用的凝胶浓度越小,如分离的DNA片段在0.2~1kh间,一般凝胶浓度为1.5%~2%。可预先在琼脂糖中加入0.5μl/ml溴乙啶(EB)或在电泳后凝胶用电泳缓冲液配制同样浓度的EB液染色15~30分钟,电泳缓冲液有1-TBE或TAE,电压降选择在1~5V/cm,电泳分离,紫外灯下观察结果并拍照记录。

聚丙烯酰胺凝胶电泳:聚丙烯酰胺凝胶分辨率比琼脂糖高,分离小片段DNA(5~500bp)的效果较好,甚至可以分辨相差1bp的DNA片段,因此若DNA片段相差较小或要检测PcR产物的长度多态性,则应用聚丙烯酰胺凝胶分离,通过银染或放射自显影检测。

反转录PCR

反转录PCR,或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR),是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中,一条RNA链被反转录成为互补DNA,再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环,收集一个荧光强度信号,这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线。

多重PCR

多重PCR(multiplex PCR),又称多重引物PCR或复合PCR,它是在同一PCR反应体系里加上两对以上引物,同时扩增出多个核酸片段的PCR反应,其反应原理,反应试剂和操作过程与一般PCR相同。多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定,以及病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定。

免疫PCR

免疫PCR(immuno PCR,Im-PCR)主要由两个部分组成:第一部分免疫反应类似于普通的酶联免疫吸附实验(ELISA)的测定过程;第二部分即通常的PCR检测,抗原分子的量最终由PCR产物的多少来反映。第一步中,首先用待测抗原(如牛血清白蛋白)包被微滴板孔,再加入相应的特异抗体,于是抗体就与固相上的抗原结合形成抗原抗体复合物,蛋白A-链亲和素(protein A-streptavidin)嵌合体(重组融合蛋白)中的蛋白A部分可与固相上抗原抗体复合物中的抗体IgG结合,而链亲和素部分可与生物素化的pUC19(质粒DNA)(biotin-pUC19)中的生物素反应,从而将特定的DNA间接吸附于固相。接下来,就是第二步中的PCR过程,第一步中吸附于固相的pUC19质粒DNA在相应的引物存在下,可经PCR在几小时内而放大数百万倍,PCR产物的多少与固相上抗原的量成正比。

原位PCR

原位PCR(in situ PCR)是Hasse等于1990年建立的技术,就是在组织细胞里进行PCR反应,它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点,是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。原位PCR既能分辨鉴定带有靶序列的细胞,又能标出靶序列在细胞内的位置,对分子和细胞水平上研究疾病的发病机制和临床过程及病理的转归有重大的实用价值。

聚合酶链式反应在精子研究中的运用

Y染色体上性别决定区域(SRY)基因的检测

人类个体的表型性别是由Y染色体决定的,具体说是由Y染色体编码睾丸发育决定因子(testis determining factor,TDF)基因所决定。TDF基因的存在决定着睾丸的发育,即决定个体发育为男性。研究表明,TDF基因位于Y染色体断臂与拟常染色体相连的35kb区域,该区域又称为Y染色体性别决定区(sex determining region of the Y,SRY)。其方法为在SRY基因区域设计一对引物,利用引物Y1.5/Y1.6扩增出239bp的片段。

利用PCR技术扩增SRY基因片段检测性别具有广泛的实际应用价值,如结合细胞遗传学的核型分析,通过确认SRY所在区域的缺失或易位,可诊断46,XY女性或46,XX男性性反转综合征的患者;还可通过检测胎儿的性别,预防甲型血友病、G6PD缺乏症等X连锁遗传病患儿的出生。

精子发生相关基因检测分析

研究者证明Y染色体的变异可导致精子生成障碍,出现无精子、严重少精子或精子畸形。1976 年Tiepolo和Zuffardi发现无精子症患者Y染色体长臂远端部分缺失,因此提出Y染色体长臂非荧光区域存在控制精子发生的基因,由于该基因缺失患者多数表现为无精子症,故将其称为无精子因子(azoospermia factor,AZF)。随后许多学者的研究证明了这一假设,控制精子发生的AZF基因位于Y染色体长臂远端第6区,相当于Yqll,23区域,并可能延伸至Y染色体长臂的中部,而且并非单一基因,可能是含有多个基因的大家族。近年来,研究发现控制精子发生的相关基因,主要包括位于Y染色体AZFa区的USPgY(chromosorne Y ubiquitin specific protease 9)基因和DBY(DEAD/ H box 3 in Y chromosome)、AZFb区的RBM(RNA-binding rnotif)基因、AZFc区的DAZ(deleted in azoospermia)基因和位于常染色体的DAZLA基因等在分子遗传学研究方面均取得了可喜的进展。

精子线粒体基因的检测

线粒体是细胞中能量储存和供给的场所,它含有独立的半自主复制DNA遗传系统,冯春琼报道弱精子症样本中MTCYB和MTATP6基因的缺失率分别为20%和5%。扩增片段的序列分析发现,在弱精子症样本中,MTATP6基因出现G8887A的点突变,突变率为20%,而MTCYB基因未见有规律的突变。精子活力正常的样本中MTCYB、MTATP6基因未检测到明显的点突变精子线粒体MTCYB和MTATP6的基因缺失以及MTATP6基因的G8887A突变可能影响成年男性的精子活力。说明线粒体功能缺陷是精子活力降低的原因之一。

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