Y染色体微缺失检测

一、试剂

  1. 1×TE:0.01M Tris,1mM EDTA,pH 8.0;
  2. 细胞裂解液:50mM KCl,20mM Tris,2.5mM MgCl2,0.5%Tween-20,10μg/ml蛋白酶K,pH 8.3;
  3. 10×PCR Buffer;
  4. TaqTMDNA聚合酶;
  5. 其他:去离子水,dNTPs。

二、方法

(1) DNA提取:

  1. 抽取无精子症患者外周血用EDTAK2抗凝,取50μl置1.5ml管中。
  2. 加入1ml1×TE,吹打混匀,9000g离心15秒。
  3. 去上清,沉淀再加1ml1×TE,吹打混匀,9000g离心15秒。
  4. 重复步骤3)1次。
  5. 沉淀用100ml细胞裂解液悬浮,吹打混匀,55℃孵育45分钟,间断摇动。
  6. 煮沸10分钟灭活蛋白酶K。

(2) PCR:PCR程序:95℃预变性5分钟;95℃变性30秒;55℃退火30秒;72℃延伸40秒;扩增30个循环;最后72℃延伸5分钟。

 以上成分在冰上混匀。

以上成分在冰上混匀。

(3) 电泳:PCR扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯观察分析结果。

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