人类G显带核型的制备及分析

一、原理

染色体的化学成分是核酸和蛋白质两部分。核酸以DNA为主,蛋白质有组蛋白和非组蛋白两种。因此染色体经蛋白水解酶类物质处理后,蛋白质已被水解而使DNA分子中碱基暴露,由于碱基中G/C和A/T组合的比例不同,对染料结合的程度不一,这样在染色体上呈现出深浅不一的条纹或者称带纹,该技术用Giemsa染色,故其带型称为G带。G带是目前用得最多的一种带型。

二、试剂

①1640培养基;②秋水仙素;③0.075mol/L KCl溶液;④甲醇;⑤冰醋酸;⑥0.125%胰蛋白酶溶液;⑦Giemsa溶液。

三、方法

1. 外周血淋巴细胞培养

  1. 采血:用一次性2ml注射器抽取肝素稀释液0.2ml,湿润针管,然后将多余的肝素排出。
  2. 接种和培养:在无菌室内的超净工作台上,或用酒精消毒培养瓶的翻口瓶塞后插入针头,将抽取的抗凝血迅速接种到5ml含适量PHA(约0.2ml)及小牛血清的培养瓶中,每瓶接种全血0.4ml左右,轻轻摇匀,置37℃培养箱中培养,根据实验需要与具体情况(如各实验室条件、试剂的影响等)可培养48~72小时。
  3. 积累中期细胞:在终止培养前4~6小时,用1ml注射器(装5号针头)加入浓度为5μg/ml的秋水仙素2滴,使培养液中的秋水仙素终浓度为0.05μg/ml。轻轻摇匀,放回培养箱中继续培养至72小时。加入秋水仙素的目的在于抑制纺锤丝的形成,使细胞分裂停止在中期。

2. 染色体标本的制备

  1. 收获细胞:取出培养瓶,将培养液摇匀后倾入10ml刻度离心管中,在粗天平上配平后放入离心机,以1500r/min离心8~10分钟,吸弃上清液,保留细胞悬液约0.5ml。
  2. 低渗处理:往离心管中加入8ml已温浴达37℃的0.075mol/L KCl溶液,用吸管混匀,置37℃恒温水浴箱中低渗15~25分钟(精确的低渗时间可自行摸索)。
  3. 预固定:低渗处理完成后,加入1ml新配制的固定液(甲醇与冰醋酸为3∶1)并用吸管混匀,平衡后放入离心机,以1500r/min离心8~10分钟。吸弃上清液。
  4. 固定:加入6ml固定液,用吸管将沉淀的细胞轻轻混合成细胞悬液,室温下静置20分钟后,1500r/min离心8~10分钟。吸弃上清液。
  5. 再固定:加入6ml固定液,用吸管轻轻吹打使细胞混匀,室温下静止15分钟或更长时间。
  6. 制片:将上述细胞混悬液离心(1500r/ min,8分钟),吸弃上清液。视离心管中沉淀(细胞)的多少加入0.2~0.4ml左右的固定液,用吸管轻轻混成细胞悬液。用吸管吸取细胞悬液以20~35cm高的距离滴于清洁预冷的玻片上,每片滴2~3滴,滴完后立即对准玻片吹气以助细胞的分散,并立即将玻片放在酒精灯火焰上来回过几下(勿烤干),静置并空气中晾干。

3. G显带

  1. 胰蛋白酶准备:在盛有50ml的0.85%氯化钠溶液的染色缸中加入0.25%胰蛋白酶3ml,调节pH 6.8~7.2,置37℃恒温水浴箱预温。
  2. 胰蛋白酶消化处理:将经老化处理的标本放入胰蛋白酶中处理2~3分钟。
  3. 漂洗:迅速用0.85%生理盐水漂洗,以终止胰蛋白酶的作用。
  4. 染色:用Giemsa染液(以1份Giemsa原液加9份pH 6.8的PBS液混合而成)染色5~10分钟。
  5. 冲洗干燥:用缓流自来水冲洗玻片,空气干燥。

四、G显带核型染色体核型分析

将制片置于低倍镜下观察,选择染色体分散好,无胞浆背景的中期分裂象,然后换高倍镜、油镜观察染色体形态,在镜下初步计数。选择合适的分裂象,记录坐标,在纸上画出示意图,进行核型分析。G带染色体的特征如下:

1. 第1号染色体:短臂的近侧1/2处有2个深带,远侧有一半几乎为浅染区;短臂共分3区。界标为近侧的深带(2区1带)和中段的深带(3区1带)。长臂近侧为一窄的浅带。中段和远侧段各有2条深带;长臂共分4区,界标为次缢痕远侧的浅带(2区1带)、中段的深带(3区1带)和远侧的深带(4区1带)。

2. 第2号染色体:短臂可见4条深带。中段的2条深带常互相靠近,表现为1条深带;短臂共分2区,界标为1浅带(2区1带)。长臂可见4~7带,近侧着色甚浅,中段及远侧着色较深;长臂共分3区,界标为2个浅带(2区1带和3区1带)。

3. 第3号染色体:短臂近侧可见2条深带;远侧可见3条深带,其中远端的1条带较窄,染色浅;短臂分为2区,界标为1浅带(2区1带),长臂近侧和远侧各有1条较宽的深带:好的标本近侧深带可分为2条深带,远侧深带可分为3~4条深带;长臂分为2区,界标为1浅带(2区1带)。长臂深带宽度略大于短臂深带。

4. 第4号染色体:短臂有1~2条深带,只1区。长臂有均匀分布的4条深带;长臂分3区;界标为2浅带(2区1带和3区1带)。

5. 第5号染色体:短臂有1条深带,只1区。长臂有5条深带,中段的3条深带常靠近;长臂分3区,界标有1深带(2区1带)和1浅带(3区1带)。

6. 第6号染色体:短臂近侧有1宽的浅带,远侧为1深带;短臂分2区,界标为1浅带(2区1带)。

7. 第7号染色体:短臂有2~3条深带,近末端带着色很深;短臂分2区,界标为1深带(2区1带)长臂有3条深带,近侧和中部的2条带较深;长臂分3区,界标为2深带(2区1带和3区1带)。

8. 第8号染色体:短臂有2条深带,远侧深带较近侧深带着色深;短臂分2区,界标为1浅带(2区1带)。长臂有3~4条深带,远中的深带着色较深;长臂分2区,界标为1深带(2区1带)。

9. 第9号染色体:短臂有1~2条深带;短臂分2区,界标为1深带(2区1带)。长臂2条深带。长臂分3区,界标为2深带(2区1带和3区1带)。

10. 第10号染色体:短臂有2条深带,近侧较近侧深带着色浅;短臂只1区。长臂有3条深带,近侧深带着色更深;长臂分2区,界标为1深带(2 区1带)。

11. 第11号染色体:短臂有1~2条深带;短臂只1区。长臂有2条深带,在近侧深带与着丝粒之间有1宽的浅带;长臂为2区,界标为1浅带(2区1带)。

12. 第12号染色体:短臂有1条深带;短臂只1区。长臂有3条深带,中间的1条深带宽,近侧深带与着丝粒的距离较第11号染色体近;长臂分2区,界标为1深带(2区1带)。

13. 第13号染色体:长臂有4条深带,中间2条深带宽;长臂分3区,界标为中间的2条深带(2 区1带及3区1带)。

14. 第14号染色体:长臂有45条深带,近侧的第2条带和远侧的带着色更深;长臂分3区,界标为2条深带(2区1带和3区1带)。

15. 第15号染色体:长臂有4条深带,近侧的第2条带较宽;长臂分2区,界标为1深带(2区1带)。

16. 第16号染色体:短臂有1~2条深带,短臂只1区。长臂有2条深带,近中部深带明显;长臂分2区,界标为1深带(2区1带)。

17. 第17号染色体:短臂有1深带;只1区。长臂1~2深带,远侧深带较宽,在深带与着丝粒之间有1宽的浅带;分2区,界标为浅带(2区1带)。

18. 第18号染色体:短臂为1浅带区。长臂有2条深带;为2区,界标是1浅带(2区1带)。

19. 第19号染色体:着色最浅。着丝粒周围为深带。短臂和长臂均为1区。

20. 第20号染色体:短臂有1深带,较宽;短臂和长臂均为1区。长臂有1深带,较宽。

21. 第21号染色体:最小的1个染色体。长臂紧按着丝粒处有1深带,较宽;长臂为2区,界标为1深带(2区1带)。

22. 第22号染色体:较21号色体长,长臂紧接着丝粒处有1深带,较窄。短臂和长臂均为1区。

23. X染色体:短臂中部有1条深带;分2区,界标是深带(2区1带)。长臂有4条深带,其中近槽深带最宽;分2区,界标是近侧深带(2区1带)。

24. Y染色体:长臂远侧半色着深,为1深带;短臂和长臂均为1区。

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