生殖内分泌激素测定

生殖激素的测定,过去主要采用放射免疫分析(radioimmunoassay,RIA)或酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)的测定技术。随着免疫学测定技术的发展,近年来,一些先进测定方法相继诞生,包括化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLLA)和电化学发光免疫分析(electro-chemiluminescence immunoassay,ECLIA)在内的技术已能准确、快速、特异和灵敏地测定血液中各种激素浓度。

放射免疫分析技术

放射免疫分析技术(radioimmunoassay,RIA)是20世纪60年代发展起来的一项微量技术,这种方法具有高度的灵敏度和精确性,特异性强,操作方法简单,应用范围广,迄今可用本技术测定的体内微量生物活性物质,如激素、蛋白质、抗体、维生素、药物等,对临床各科的疾病诊断和医学基础研究具有重要意义。

一、原理:放射免疫分析是将具有高灵敏度的放射性核素示踪技术与高度特异性的免疫化学技术结合而建立起来的分析方法,以放射性核素标记的抗原为示踪剂,以非标记抗原(标准抗原或被测抗原)为检测对象,共同与限量的特异性抗体进行竞争性免疫结合反应,由于标记抗原与抗体的结合量(因变量)与非标记抗原的含量(自变量)之间,存在竞争性抑制的反函数关系,可依据反映这一函数关系的标准曲线,求出被测抗原的含量。

二、试剂:RIA的基本试剂有四种,即抗体、放射性核素标记抗原、非标记抗原(已知浓度标准品)和分离剂。目前,生殖激素都有相应的试剂盒。

  1. 标准品:标准品用来得出标准曲线,必须高纯度,符合国际参考标准。应与待测物质的理化性质、相对分子质量、化学结构完全一致。
  2. 抗体:用于制备抗体的抗原应具有一定的分子量、合适的异己性和一定的溶解度,要求免疫原性和反应原性要好。甾体激素如睾酮、双氢睾酮等为半抗原,只有抗原性而无免疫原性,只有同大分子蛋白联结(如人血清白蛋白、牛血清白蛋白)才可引起抗体的产生。
  3. 放射性核素标记抗原:常用125碘(125I)、3氢(3H)进行标记。甾体激素测定多采用3H进行标记。
  4. 分离剂:RIA测定使用的抗原、抗体量极微,所产生的抗原复合物也很少,因此要将其与反应体系中的游离物分开,需采取特殊的分离方法。常用的分离方法有吸附法和双抗体分离法,以双抗体分离法应用最为广泛。

化学发光法免疫分析技术

化学发光分析法(chemiluminescence immunoassay,CIA)是近30年来发展起来的一种高灵敏的微量及痕量分析法,具有仪器设备简单,操作方便,灵敏度高(10-19mol/L),线性响应范围宽和易于实现自动化等显著优点。近年来,在改进和完善原有发光试剂和体系的同时,新发光试剂的合成,新体系的开发,及与其他技术的联用,更显示出化学发光分析的优点,也进一步拓宽了化学发光的应用范围,是继放射免疫分析、酶联免疫分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。目前,临床上多采用化学发光分析方法检测生殖激素。

一、化学发光原理

化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合,用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。

二、化学发光免疫分析种类

1. 直接化学发光

  1. 吖啶酯发光:纳米磁珠分离后的吖啶酯标记的抗原抗体复合物,在含H2O2的强酸、强碱激发底物的作用下,快速发出可见光,通过光电倍增管进行光子计数,相对光强度RLU与待测抗原浓度呈函数关系。
  2. 异鲁米诺发光:发光过程和原理与吖啶酯完全相同,但激发发光速度更快,在3秒内完成整个过程,测试速度最快,而且克服了吖啶酯在缓冲液中不稳定、易水解的缺点。
  3. 电化学发光:纳米磁珠分离后的三联吡啶钌标记的抗原抗体复合物,在三丙胺的作用下,发生氧化还原反应,发出可见光,通过光电倍增管进行光子计数,相对光强度RLU与待测抗原浓度呈函数关系。

2. 酶促化学发光或持久发光

促化学发光一般是将碱性磷酸酶标记在抗体或抗原上,纳米磁珠分离后的碱酶标记的抗原、抗体复合物在发光底物AMPPD作用下,持续发出可见光,通过光电倍增管读取光信号。

三、化学发光免疫分析的优点

  1. 灵敏度高:如化学发光底物(如AMPPD)可检测出的碱性磷酸酶的浓度比显色底物要灵敏5×105倍。
  2. 宽的线性动力学范围:光强度在4~6个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系。这与显色的酶免疫分析吸光度(OD值)为2.0的范围相比,优势明显。虽然RIA也有较宽的线性动力学范围,但放射性限制了其应用。
  3. 光信号持续时间长:光型(glow type)CLIA产生的光信号持续时间可达数小时甚至1天,简化了实验操作及测量。
  4. 分析方法简便快速:大多数分析测定均为仅需加入一种试剂(或复合试剂)的一步模式。
  5. 结果稳定、误差小:品系直接自己发光,不需要任何光源照射,免除了各种可能因素(光源稳定性、光散射、光波选择器等)给分析带来的影响,使分析结果灵敏、稳定、可靠。
  6. 安全性好及使用期长:上述优点前提下,更免除了使用放射性物质。到目前为止,还未发现CLIA的危害性。试剂有效期可长达1年以上,放射免疫分析由于放射性核素的衰变,一般有效期只有1个月,而酶联的底物贮存性差,都无法与化学发光相比,有效期长,可以提高劳动效率,也利于推广应用。

睾酮测定

1. 原理(ECLIA法):待测抗原(T)、钌标记的T竞争性地与生物素化的抗T单克隆抗体结合,待测抗原(T)的量与钌标记的T和生物素化的抗T单克隆抗体所形成的免疫复合物的量成正比。加入链霉亲和素包被的微粒,免疫复合物通过生物素与链霉亲和素间的反应结合到微粒上。在磁场作用下,微粒通过磁铁吸附到电极上,未结合的物质被清洗液洗去,电极加电压后产生化学发光,通过光电倍增管进行测定。

2. 试剂:①链霉亲和素包被的微粒;②生物素化的抗睾酮单克隆抗体;③钌(Ru)标记的睾酮多肽;④质控(Q.C)血清。

3. 操作:按仪器操作说明进行,只需分离血清上机,包括加样、分离、搅拌、温育、结果在内的各项操作均由仪器自动进行。

4. 正常参考值:男性:2.8~8.0ng/ml。由于产品不同及各地区实验室的差异,实验室可以有自己的参考值。

垂体促性腺激素测定

促黄体素测定(ECLIA法)

1. 原理:待测样品、生物素化的抗促黄体生成素(LH)单克隆抗体与钌(Ru)标记的抗促黄体生成素(LH)另一位点单克隆抗体混匀,形成双抗夹心的抗原抗体复合物,加入链霉亲和素包被的微粒与之结合,在磁场作用下,微粒通过磁铁吸附到电极上,未结合的物质被清洗液洗去,电极加电压后产生化学发光,通过光电倍增管进行测定。

2. 试剂:①链霉亲和素包被的微粒;②生物素化的兔抗促黄体生成素(LH)抗体;③Ru(bpy)32+标记的促黄体生成素(LH)-多肽;④质控(Q.C)血清。

3. 操作:按仪器操作说明进行,只需分离血清上机,包括加样、分离、搅拌、温育、结果在内的各项操作均由仪器自动进行。

4. 正常参考值:男性:1.7~8.6mIU/ml,由于产品不同及各地区实验室的差异,实验室可以有自己的参考值。

卵泡刺激素测定(ECLIA法)

1. 原理:待测样品、生物素化的抗卵泡刺激素(FSH)单克隆抗体与钌(Ru)标记的抗卵泡刺激素(FSH)另一位点单克隆抗体混匀,形成双抗夹心的抗原抗体复合物,加入链霉亲和素包被的微粒与之结合。在磁场作用下,微粒通过磁铁吸附到电极上,未结合的物质被清洗液洗去,电极加电压后产生化学发光,通过光电倍增管进行测定。

2. 试剂:①链霉亲和素包被的微粒;②生物素化的抗FSH单克隆抗体;③Ru(bpy)32+标记的抗FSH单克隆抗体;④质控(Q.C)血清。

3. 操作:按仪器操作说明进行,只需分离血清上机,包括加样、分离、搅拌、温育、结果在内的各项操作均由仪器自动进行。

4. 正常参考值:男性:1.5~12.5mIU/ml。由于产品不同及各地区实验室的差异,实验室可以有自己的参考值。

泌乳素测定

  1. 原理(ECLIA法):待测样品、生物素化的抗泌乳素(PRL)单克隆抗体与钌(Ru)标记的抗泌乳素(PRL)另一位点单克隆抗体混匀,形成双抗夹心的抗原抗体复合物,加入链霉亲和素包被的微粒与之结合,在磁场作用下,微粒通过磁铁吸附到电极上,未结合的物质被清洗液洗去,电极加电压后产生化学发光,通过光电倍增管进行测定。
  2. 试剂:①链霉亲和素包被的微粒;②生物素化的抗泌乳素单克隆抗体;③Ru(bpy)32+标记的抗泌乳素单克隆抗体;④质控(Q.C)血清。
  3. 操作:按仪器操作说明进行,只需分离血清上机,包括加样、分离、搅拌、温育、结果在内的各项操作均由仪器自动进行。
  4. 正常参考值:男性:86~324μIU/ml。由于产品不同及各地区实验室的差异,实验室可以有自己的参考值。

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