确定疾病的遗传方式有助于疾病的诊断和预后估计,遗传咨询和优生优育措施可预防遗传病的发生和加重,并能及早预防亲属发生相关疾病。遗传方式可根据家系调查的患病情况予以确定。

性染色质为染色体异常诊断提供依据

根据Lyon假说,女性两条X染色体仅有1条是有活性的,另1条X染色体在正常的间期细胞核中螺旋化而异固缩(heteropycnosis)为X染色质(X chromatin),它常在间期细胞核中紧贴核膜内缘,呈三角形或半月形小体(Barr小体)。通过碳酸复红或硫堇等染料染色可使Barr小体着色而检测出来。男性由于仅存在1条有活性的X染色体,故Barr小体阴性。男性Y染色体位于间期细胞核近中央部,易被盐酸阿的平染色,荧光显微镜下发出较强荧光的点状小体,实际上发光部分是Y染色体异固缩的长臂。通过这种荧光染色法可显示Y染色质。

染色体显带(chromosome banding)为染色体疾病的诊断提供了重要依据。在细胞分裂周期中,染色体呈现伸展与凝缩的周期性变化,分裂期染色体的形态较非分裂时更容易观察,特别是细胞分裂中期,染色体的形态最清楚,长短大小恰到好处,是观察和分析染色体的最好时期,一般采用体外细胞培养来获得分裂期细胞,为了尽可能获得最适于分析的染色体,可以通过提高细胞分裂象数量以得到较多的中期分裂象或通过促进染色体分散的措施来达到此目的。

大多数培养细胞群在指数增殖期时,细胞分裂指数为1%~5%,其中二倍体细胞和初代培养细胞较低,平均1%~2%,另一些初代淋巴细胞培养则很少出现分裂,由于促细胞增殖剂如植物血凝素能强烈刺激T淋巴细胞增殖,所以常用于外周血淋巴细胞培养。虽然处于指数增殖期的培养细胞分裂活跃,分裂象较多,但这些分裂象并不同步,且处于分裂中期的细胞不多,故需进一步采用阻抑中期分裂的方法。秋水仙碱(colchicin)具有特异抑制纺锤丝蛋白合成的作用,能阻抑分裂中期活动,而对DNA影响较小,常用于截获中期分裂象。

用相差显微镜能观察到染色体上存在的带纹,用特殊方法处理染色体后,再用染料染色,能使这些带型更加清楚,表现为沿染色体长轴色深浅不同的横向带纹。但需注意,不同的显带方法和不同染料处理的染色体带型可有不同。各种染色体显带技术能在人中期细胞的1个染色体组中显示320条带,与非显带的染色体检查法相比,前者提供有关染色体结构的细节更细致而精确,为染色体疾病的诊断提供了更为有效的方法。

高分辨显带精确定位染色体断裂点

显带所用的均是中期染色体,它在细胞分裂周期中经历了高度螺旋化,收缩变短和带纹融合的过程,因此仅能显示约320条带。为了获得更长带纹的染色体,可采用甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷使前期细胞同步化和特殊的染色技术。用放线菌素D(actinomycin D)处理以防止细胞DNA的收缩,可以显示前中期染色体上1256条带,在晚前期染色体上可显示1700条带,早前期细胞上可显示3000条或更多带纹,这种方法称为高分辨染色体显带法。这一技术的应用提高了染色体分析的质量,可以检出更细微的染色体畸变,可精确定位断裂点。

原位杂交将DNA片段精确定位到特定条带

高分辨染色体显带技术提高了染色体分析的能力。但在光学显微镜下,对4500kb以下的染色体异常往往无法分辨,综合使用分子生物学技术就能对这些异常进行有效的检测。其原理是利用已知DNA序列,用放射性核素标记后作为探针,探针与待测染色体DNA进行分子杂交,如果该探针与待测染色体上的同源序列(靶序列)互补结合,即可在间期核或染色体上显示杂交信号,显示靶序列的位置。这种方法可以精确地把某一DNA片段定位到某条染色体的特定区域(条带)上。在染色体原位杂交放射性核素标记探针技术基础上,又发展了荧光标记原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)。这种方法是先把DNA探针标记上半抗原如生物素-dUTP(biotin-deoxyuridine triphosphate),再与染色体标本杂交,然后使生物素-dUTP与荧光标记的抗生物素抗体结合,杂交信号可在荧光显微镜下观察。荧光原位杂交技术由于不需要放射性核素,而且特异性和灵敏度较高,快速安全,现已广泛应用于染色体畸变检测和基因定位中。

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