生精细胞及精子凋亡的检测

生精细胞凋亡的检测

精液中的细胞,传统认为是“白细胞”,实际上大部分是生精细胞,因未进行染色分类,容易造成误诊。随着细胞凋亡学说的确立与发展,精液中生精细胞检查和生精细胞凋亡的观察,目前已成为精液分析的一项重要指标。

瑞-吉染色、DNA缺口原位末端标记技术(TUNEL)染色(详见四十一章)和流式细胞术(详见四十二章)是检测生精细胞凋亡常用的方法。

精子凋亡的检测

精子凋亡与体细胞凋亡一样,在形态上主要是核固缩,胞质膜起泡,膜内的磷脂酰丝氨酸外翻,细胞器缩聚,凋亡小体形成;在组织学上表现为单个细胞的缺失,周围没有炎症反应;生物化学方面主要表现为线粒体膜电位的改变,活化Ca+依赖的核酸内切酶,使染色质DNA降解成单或寡核苷酸小体。

常用的精子凋亡检测技术有:

Annexin V-FITC/PI检测

凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸(Ps)可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面。膜Ps外翻被认为是细胞早期凋亡最明显的标志,大多数学者根据此特征对细胞早期凋亡进行研究。AnnexinV(AN)是一种磷脂结合蛋白,能与Ps高亲和力结合。将AnnexinV进行荧光素(FITC)标记,结合流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中、晚期的细胞和死亡细胞,PI能透过胞膜而使细胞核红染。因此将AnnexinV与PI匹配使用,就可以区分正常细胞(ANPI)、早期凋亡细胞(AN+PI)、晚期凋亡(AN+ PI+)和死亡细胞(ANPI+)。

线粒体膜电位检测

精子线粒体是精子获能后提供能量的重要细胞器,由于线粒体膜上各种生物泵的作用,使膜内外维持着不同梯度的离子浓度,同样也使线粒体产生膜电位。凋亡时由于膜磷脂双分子层的不对称性被破坏,导致细胞线粒体膜电位的丧失,因此对线粒体膜功能的评估很可能成为观察早期细胞凋亡的有力工具。

单细胞凝胶电泳法

又称彗星法(comet assay)。其原理是:精子细胞DNA的断裂造成超螺旋结构变得松散,同时暴露了负电荷。损伤DNA片段在电场力作用下从核内迁出,向阳极迁移,从而形成“彗星”样脱尾,然后在荧光显微镜下进行分析。根据细胞荧光图像是否像彗星样细胞,计数一定量细胞中彗星细胞所占的比例,估计DNA的损伤程度;还可以在显微镜下或在照片上测出彗星细胞的一些长度数值,如尾长和彗星细胞总长、尾长与头部直径比值等,在低损伤剂量范围内其与损伤呈线性关系。SCGE的主要参数有:彗星样细胞发生率、尾部总荧光强度、尾长和尾矩。

原位标记法

原位标记法是将掺入到凋亡细胞中的外源性核苷酸在酶的催化下与凋亡细胞中的单股或双股链相结合,其结果可用流式细胞仪、荧光显微镜或光学显微镜检测。原位标记的方法有两种:原位缺口平移法(ISNT)和TUNEL。ISNT由DNA聚合酶Ⅰ催化反应,常用的标记物为生物素或地高辛;TUNEL由末端转移酶催化反应,常用的标记物为异硫氰荧光素(FITC)。两者的不同在于:DNA聚合酶Ⅰ的催化作用必须有模版链和引物存在,所以ISNT不能标记平头末端的缺口。

精子染色质结构分析

精子染色质结构分析(sperm chromatin structure assay,SCSA)。精子核由精核蛋白和DNA组成。精子进入附睾后,精核蛋白中大量的巯基(SH)不断氧化成二硫键(S—S),与DNA紧密结合使其更具抗酸能力,维持双链结构的稳定。而那些受到损伤或未成熟精子的精核蛋白的SH未被氧化,形成松散结构的染色质,其DNA在酸的作用下变性成单链。吖啶橙(AO)可与双链DNA结合呈单体形式发出绿色荧光,与单链DNA结合呈聚合物形式发出红色或黄色荧光。通过配有专用软件的流式细胞仪可进行数据处理得出SCSA参数,主要包括COMPort(cells outside the mainpopulation)、SDott、HIGRE(high green stain ability)。SCSA检测是由Evenson等建立的,他们对SCSA参数用于男性生育力的评估和预测临床不孕进行了大量研究,得出评估生育潜能的阈值;COMPm为0~15%时具有高生育潜能;16%~29%具有中等生育潜能;≥30%具有低生育潜能;80%~90%无生育能力。Virro等研究了SCSA参数与IVF和ICSI后受精率、胚泡发育、妊娠的关系,认为DNA碎片指数可作为预测IVF、ICSI结果的一个有力指标。检测方法见三十七章。

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