生精细胞凋亡分子机制及调控

精子的发生与调节

精子的发生与代谢活动

一、精子的发生:由精原干细胞经过一系列发育阶段发展成为精子的过程称为精子发生。此过程可分为三个阶段:①精原细胞经过数次有丝分裂,增殖分化为初级精母细胞;②初级精母细胞经过两次成熟分裂(中间经历短暂的次级精母细胞阶段)变为精子细胞,在此阶段中染色体数目减少一半,故又称减数分裂;③精子细胞不再分裂,而是经过一个变形过程由圆形的精子细胞发育为蝌蚪状的精子,此过程又称为精子形成(spermiogenesis)。具体请参见本书第二章。

二、精子发生过程中的代谢活动:除了形态学上的巨大变化以外,各级生精细胞合成蛋白质的程度也不尽相同:初级精母细胞>精原细胞>次级精母细胞>早期精子细胞,晚期精子细胞几乎无蛋白质合成。睾丸内血流缓慢,内环境较缺氧,糖的有氧代谢受限,尤其是近腔面的生精细胞,以糖酵解代谢占优势。

精子发生的调节

精子发生过程除受到基因调控之外,也受到内分泌因素和局部因素的调节。以下仅简要综合介绍,具体请参见相关栏目。

一、精子发生的基因调控

生殖系统的特异基因可以在支持细胞、间质细胞以及生精细胞中表达。包括调节精原干细胞的增殖和更新的C-Kit/SCF基因、调节生精细胞周期的周期蛋白(cyclin)基因、减数分裂基因也称卵巢睾丸转录基因(overy testis transcribed gene,Ott gene)和参与精子形成的硒蛋白基因(MCS)等等。

二、精子发生的内分泌调控

已知下丘脑分泌的促性腺激素释放激素(GnRH)和催乳素释放激素(PRH)作用于垂体前叶细胞,使后者分泌卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)和催乳素(PRL)。LH作用于睾丸间质细胞膜上的LH受体,使间质细胞睾酮合成增加。尽管PRL单独使用不能使间质细胞合成睾酮增加,但是PRL能够增强LH的作用,促使间质细胞的睾酮合成增加。睾酮在生精小管内可与雄激素结合蛋白(ABP)结合形成复合物,由此复合物对精子发生起调节作用。此外,FSH通过支持细胞的介导对精子发生起调节作用。

三、精子发生的局部调节

研究表明,多种生长因子诸如表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors,IGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)以及生长素、活化素和抑制素等,对精子发生有直接或间接的调节作用。

生精细胞凋亡的分子机制

Fas/Apo-1系统

Fas/Apo-1基因是近年来在哺乳动物多种组织中发现的一种编码凋亡信号受体基因。其编码的跨膜受体蛋白属于肿瘤坏死因子、神经生长因子受体家族,成员间保守的同源性局限在细胞外半胱氨酸丰富的区域,但受体和细胞内死亡域(death domain)有同源性。多组织杂交显示,睾丸组织中配基的表达量最高,只是长度比其他组织短些。抗原在用抗体处理或与自然存在的配基相互作用后,可诱发自身三聚化或寡聚化,从而活化并传导凋亡信号,引起Fas所在的靶细胞在数小时内死亡。

此外,用免疫组化方法定位大鼠睾丸内生精细胞表达Fas,而支持细胞表达FasL。这两种基因的表达在2,5己二酮(2,5hexanedione,支持细胞毒性剂,已知可诱导生精细胞凋亡)作用下明显增强。用反义寡核苷酸处理破坏支持细胞的FasL后,大鼠生精细胞凋亡减少。上述研究结果提示Fas系统是调节睾丸生殖细胞凋亡的关键因素之一。此外,由于在睾丸内Fas系统涉及维持睾丸的免疫赦免(immune privilege)状况,因此,有关Fas与淋巴细胞凋亡的关系值得进一步研究。

bcl2和Mcl1

bcl2最初是从B细胞淋巴瘤的t(14,18)染色体断裂点(chromasomal breakpoint)发现的,有人提出该基因作为一个癌基因(oncogene)能够防止肿瘤细胞的死亡。bcl2缺失的转基因小鼠(transgenic bcl2-deficient mouse)可完成胚胎发育,但体重明显减轻而且出生后早期死亡率增高。bcl2编码一个相对分子质量约26 000的蛋白质,此蛋白质含有一个跨膜区域(transmembrane domain),此跨膜区域见于线粒体膜、内质网、核膜甚至有丝分裂的染色体上。用bcl2转染(transfection)细胞可防止不同刺激诱导的该细胞凋亡,这些刺激包括射线、多种化学治疗药物、蛋白激酶抑制剂、拓扑异构酶Ⅱ抑制剂和糖皮质激素等。但是,bcl2对CTL诱导的细胞死亡没有作用。Mcl1是bcl2蛋白家族的一员,编码相对分子质量大约37 000的蛋白质,与bcl2有明显的同源性,是凋亡的抑制因子,在许多长寿细胞表达。Krajewski等对正常人睾丸bcl2和Mcl1表达的观察表明,bcl2和Mcl1在最易发生凋亡的精原细胞、精母细胞中极少表达。此外,尽管Mcl-1与bcl2有明显的同源性,但它们在组织中的表达情况却有所不同:在bcl2高表达的组织中,Mcl1表达弱或不表达;在bcl2低表达的组织中,Mcl1呈高表达。睾丸间质细胞同时有Mcl1、bcl2中等程度表达。研究还发现,Smyc基因可促进生精细胞凋亡。

bax基因等凋亡抑制基因

对脊椎动物的研究表明,存在几种凋亡抑制基因。bcl2、bclX、bax与ced9形成bcl2家族(bcl2family)。bclX能编码两种不同长度的蛋白质。长的形式称bclXL,与bcl2一样能抑制凋亡。短的形式称bclXS,其作用则与bcl2相反。bclXS和bax并非自杀基因,因为当过量表达时并不能诱导细胞死亡,而是促使被剥夺生存信号的细胞对死亡更加敏感。

bax是bcl2的“对立”基因,一般认为其具有促进细胞凋亡的作用。Knudson等发现bax基因缺失的小鼠胸腺细胞和B淋巴细胞增生。但是,与此同时,这些小鼠睾丸萎缩,大量生殖细胞停留在不典型的减数分裂前期,但未见成熟的单倍体精子。此外,还见到多核巨细胞和发育的异常细胞伴有生精细胞严重凋亡,并造成小鼠不育。因此,Knudson等认为,bax基因缺失既可导致细胞增生又可导致细胞发育障碍,主要取决于细胞的类型。

P53基因与cAMP反应元素调节子

野生型P53基因对DNA修复起重要作用,又称“基因组卫士”(genome guide)。它能使细胞在DNA复制过程中“暂停”以修复损伤基因。研究发现,携带有P53启动基因与氯霉素乙酰转移酶(CAT)转基因杂交小鼠睾丸表达明显的CAT酶活性。同时其内源性P53mRNA及蛋白质低于非转基因的对照组小鼠。这些转基因小鼠睾丸出现多核巨细胞,并使得四倍体的初级精母细胞不能完成减数分裂。这种多核巨细胞也见于纯合子P53基因缺失小鼠。鉴于P53在DNA修复中的作用,估计P53在精子发生的粗线期特异性表达,以便有充分的时间供DNA重组与修复。P53表达减低的初级精母细胞可能会损害DNA修复,导致基因有缺陷的多核巨细胞形成以及生精细胞凋亡。

cAMP反应元素调节子(cyclic AMP-responsive element modulator,CREM)是一种转录激活因子,在精子细胞中高表达,对使生精细胞转变为精子的基因激活有重要作用。CREM基因突变的小鼠由于精子形成过程受阻,晚期精子细胞和精子缺如,发生凋亡的生精细胞的数量明显增加。

生长因子

转化生长因子包括转化生长因子α(transforming growth factorα,TGFα)、转化生长因子β(TGFβ)和抑制素相关肽。TGFα与表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)同源,两者都与EGF受体结合,体外具有相似的生物学功能。EGF受体在发育期睾丸中表达。睾丸支持细胞、间质细胞中存在EGF受体,而精母细胞则没有。EGF能增加睾丸中鸟氨酸脱羧酶的活性。在发育期大鼠睾丸中,该酶活性高峰出现先于精原细胞及前细线期精母细胞的DNA合成高峰。TGFβ超家族在细胞生长、分化和组织形成过程中起重要作用。在大鼠睾丸中,TGFβ1在精母细胞和早期精子细胞表达,TGFβ2在晚期精子细胞高表达,TGFβ3则从青春期开始在支持细胞明显表达。睾丸组织中TGF超家族有抗苗勒管激素(anti-Müllerian duct hormone,AMH)和抑制素(inhibin)。AMH是新生的睾丸组织产生的一个有二硫键相连的同源二聚体糖蛋白,其作用是抑制苗勒管的形成。体内、体外实验证实,精子的减少与抑制素的下降有关。在成熟的睾丸组织中抑制素、TGFβ与生精细胞谱系的形成有关。骨形态发生蛋白8B(bone morphogenetic protein 8B,BMP8B)属于TGFβ超家族,鼠类BMP8B的同源体Bmp8B在睾丸生精细胞表达。Bmp8B基因突变的雄鼠,青春早期表现为生精细胞发生障碍或分化延迟,成年鼠则表现为精母细胞凋亡增加、生精细胞减少和不育。

生精细胞凋亡的调节

生殖激素与生精细胞凋亡

生殖激素对正常生理状态下生精细胞的凋亡起关键调控作用。给8~70d不同年龄组大鼠注射长效GnRH拮抗剂(azaline-B)以抑制大鼠体内FSH和LH水平,结果发现16~32d龄大鼠睾丸中细胞凋亡的DNA片段量增加1.8~2.0倍,而8d龄和70d龄大鼠睾丸中的DNA片段量几乎未受影响,反映出凋亡与年龄有关。注射azaline-B后,精原细胞、精母细胞和精子细胞均存在凋亡,但支持细胞和间质细胞未见到凋亡发生。进一步研究发现,正常大鼠睾丸中A2、A3、A4精原细胞存在凋亡。凋亡的形态学特征为:在早期,细胞核染色质向核膜边移;至中期,被吞噬的凋亡小体部分降解;到晚期,只剩下降解的凋亡小体碎片。正常大鼠生理状态下精母细胞的前细线期、合线期、粗线期均可出现凋亡,见于生精上皮的Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ~Ⅸ、Ⅻ和■期。精子细胞凋亡水平较低,主要存在于精子形成的第Ⅳ、Ⅶ、Ⅹ、Ⅺ和■期。给成熟及未成熟大鼠注射FSH抗血清以阻断FSH的作用,发现大鼠生精细胞迅速出现凋亡(1d后),以粗线期精母细胞凋亡最多见。改用LH抗血清阻断LH的作用,发现血睾酮浓度下降,大量粗线期精母细胞凋亡,精子细胞凋亡也增加。

观察发现,腺垂体切除3d后,变性的生精细胞总数明显增加,主要发生在20~44d龄粗线期精母细胞以及精子细胞。从而认为在生殖细胞发育的特定阶段,需要适当的激素刺激及支持细胞提供营养。由于腺垂体切除,生殖细胞所需要的营养不足而导致了凋亡。

垂体促性腺激素(LH,FSH)的协同作用可影响睾丸内睾酮的水平,以维持精子的发生。这种协同作用在成年大鼠减弱。因为随着生精细胞的发育,支持细胞上的FSH受体迅速减少,使得支持细胞对LH诱导的睾酮分泌更加敏感。睾酮主要通过支持细胞内雄激素受体(AR)而发挥作用。在大鼠生精小管上皮的Ⅶ、Ⅷ期有AR的高表达,Ⅻ期则无AR表达。睾丸内睾酮含量的明显减少可能是启动生精小管上皮细胞凋亡的主要因素。

人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)替代治疗也能减少因腺垂体切除而诱发的凋亡,尽管疗效不如FSH。因为只有间质细胞存在LH/hCG的受体,所以LH、hCG对生精小管细胞的生存维持作用是由睾酮介导的。睾酮也同样能减少腺垂体切除诱发的细胞凋亡。给2~3个月龄大鼠腹腔注射一种间质细胞毒剂(EDS),能选择性杀死间质细胞,抑制血清及睾丸内的睾酮含量。注射EDS 2d后几乎所有生精小管上皮周期各个阶段的细胞都产生凋亡,尤其是Ⅶ期。睾酮替代治疗后,Ⅻ期有丝分裂前期细胞凋亡加剧。

激素对核酸内切酶活性的调节,可能与第二信使通路有关。细胞内雄激素受体是一种调节基因活性的转录因子。促性腺激素可能通过蛋白激酶-C(PKC)通路而发挥其生理作用。

支持细胞、间质细胞与生精细胞凋亡

一、支持细胞与生精细胞凋亡

精原细胞和精母细胞的凋亡,除了由于对受损细胞或携带异常染色体细胞的清除外,支持细胞和生精细胞数量平衡的维持也是原因之一。对有限生存因子的争夺等因素调节着凋亡的发生,使机体清除过多的生精细胞,保证支持细胞能支持最适数量的生精细胞。

研究发现,支持细胞功能的减退或数量的减少均可导致精子生成减少。支持细胞数与晚期初级精母细胞数和早期精子细胞数之间相关性好,而与精原细胞和早期精母细胞数之间的相关性差。老年人支持细胞数量减少,减数分裂前期的生精细胞凋亡数量增加。

过去人们曾经认为支持细胞不会发生凋亡。这主要是因为支持细胞在体内附着在富含层粘连蛋白(laminin)、胶原、基底膜聚糖和巢蛋白(nestin)等的基膜上,能通过细胞外基质得到充分的营养,所以不易发生凋亡。但是,一旦脱离基膜,支持细胞则会出现明显的凋亡。

二、间质细胞与生精细胞凋亡

给大鼠注射间质细胞毒性剂二甲基磺基乙烷(EDS),3d内就选择性地杀死了所有的间质细胞,使血清和睾丸内睾酮浓度降至可测水平之下。注射EDS 3d后的大鼠睾丸中,生精上皮Ⅱ~Ⅺ期的凋亡生精细胞增多;注射7d后,第Ⅶ期的凋亡细胞最多。实验证明,间质细胞缺乏会导致生精细胞大量凋亡,给予睾酮能有效防止EDS所造成的凋亡。当然,不排除间质细胞分泌的其他因子也影响生精细胞的凋亡。

人类睾丸中间质细胞数随年龄增长而减少。间质细胞数减少的老年人,其间质细胞体积增大,胞质增多,表明其合成和分泌睾酮的能力增强。这样,老年人睾丸间质细胞可以通过增加其睾酮分泌来弥补其数量上的减少,以防止生精细胞凋亡增加。

微生物感染与细胞凋亡

Khelef等发现,将小鼠肺泡巨噬细胞与百日咳杆菌共同培养后可发生细胞凋亡。百日咳杆菌可产生两种毒素,即百日咳毒素(PTX)和腺苷酸环化酶-溶血素(ACHLy)。细胞凋亡的诱导作用依赖于ACHLy的活性,当其进入真核细胞并被钙调蛋白激活后可合成大量cAMP,细胞中cAMP浓度升高以及cAMP依赖的蛋白激酶活力上升将导致细胞凋亡。白喉杆菌产生的白喉菌素(DTX)是一种强蛋白质合成抑制物,能直接阻断蛋白质合成的翻译过程,引起细胞坏死;同时,能诱发细胞核染色体DNA的广泛裂解,并导致细胞凋亡。溶脲脲原体(Ureaplasma urealyticum,Uu)是支原体的一种,共有14个血清型。用血清8 型Uu(T960)接种SD大鼠,可造成睾丸萎缩,支持细胞胞质空泡形成,生精细胞染色质浓集、边移,多核巨细胞大量形成,继而生精细胞严重脱落。上述Uu感染造成生精细胞的形态学变化与睾丸毒性剂己二酮引起生精细胞凋亡是一致的。将Uu与小鼠腹腔巨噬细胞(PECM-Mφ)共孵育,可使PECM-Mφ产生TNFγ的活性明显增加。Uu感染的不育患者精浆中IFNγ水平明显高于对照组。TNFα和IFNγ在细胞凋亡的过程中有诱导、促进作用,提示Uu感染与生精细胞凋亡有关。但其作用机制有待进一步阐明。

棉酚与生精细胞凋亡

已经证实乙酸棉酚(gossypol acetic acid)是抑制哺乳类生精细胞增殖的有效药物。使用棉酚导致雄性生殖细胞出现下列异常:①精子的活力下降;②精子的头部畸形;③生精细胞的DNA断裂;④生精细胞的染色体化学成分改变。上述变化的结果最终导致生精细胞死亡。

Teng将乙酸棉酚与大鼠精母细胞体外共孵育5h后,精母细胞DNA琼脂糖电泳呈现阶梯状条带。用于诱导精母细胞凋亡的棉酚浓度为100~200mol/L。进一步研究发现,在此浓度范围内,棉酚还有效地抑制精母细胞内蛋白激酶C(PKC)的活性。这种抑制作用通过测定精母细胞胞质可溶性组分和颗粒组分中所含的PKC而得到证实。而且,棉酚对PKC活性的抑制作用可被PDBu(phorbol-12,13-dibutyrate,PKC的激动剂)所抑制。PDBu还进一步抑制棉酚诱导的DNA链断裂。上述结果提示,棉酚诱导的精母细胞凋亡与PKC活性降低有关,而维持精母细胞中PKC的基本活性对于防止其凋亡非常关键。

年龄以及其他引起生精细胞凋亡的因素

Johnson研究比较了15名青壮年(平均年龄33岁)和15名老年(平均年龄65岁)男性的睾丸,发现尽管两组受试者睾丸重量有明显差别[分别为(49±3)g和(33±3)g,P<0.01],但两组每克睾丸实质内Ad、Ap和B精原细胞的数量是相似的(P>0.05)。研究还发现,老年组每克睾丸实质每日精子产生量较青壮年组低。年龄相关的生精细胞退行性变化(凋亡)主要发生在早期(细线期)到晚期(粗线期)初级精母细胞。研究发现,隐睾症患者间质细胞和生精细胞都受到影响,但发生凋亡的为精原细胞。使用hCG治疗可使隐睾症患者精原细胞凋亡减少。此外,睾丸扭转的患者对侧睾丸生精细胞凋亡增加。Hadziselimovic观察了17例睾丸扭转的患者,年龄14~34岁。为缓解单侧睾丸扭转而手术,并进行双侧睾丸活检。扭转距手术时间为0.5~11h。睾丸扭转的对侧睾丸细胞凋亡增加,尤其是早期精母细胞及晚期精子细胞。精原细胞、管周组织细胞(成纤维细胞和肌样细胞)及毛细血管内皮细胞很少发生凋亡。扭转对侧睾丸细胞凋亡程度及扭转侧睾丸细胞的坏死程度均与扭转时间有关。扭转睾丸可引起对侧睾丸功能下降。一般认为这种变化的意义是:细胞凋亡及激活凋亡的细胞因子可清除那些明显处于危险状态的细胞。

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