活性氧(ROS)的生殖毒性

实际上,人类的精液就含有潜在的ROS来源,比如过氧化物酶阳性的白细胞和形态异常的精子,会对一部分正常精子产生影响,甚至有可能损害其功能。当出现OS时,精子细胞质的抗氧化能力有限,精子的抗氧化主要依靠精浆提供的抗氧化能力,而且精子膜含有大量的PUFA,对于ROS产生的损害比较敏感。同时,ROS造成的细胞损伤不但与介质和ROS的数量有关,而且还与ROS产生时机、作用时间以及周围的环境因素有关。

精子膜的脂质过氧化

精子膜含有大量的PUFA,PUFA含有被亚甲基分离的两条双链,亚甲基中的C-H键较为脆弱,在•OH和1 O2的进攻下,从脂肪酸侧链甲烯碳中夺取氢原子可启动脂质的过氧化,脂肪酸侧链中双键数目越多越容易失去氢原子,使整个的双链发生重组,生成更稳定的脂质过氧化物,这种脂质过氧化物如果与金属离子(如铁或铜离子)通过Haber-Weiss反应产生•OH,再引发脂质过氧化链式反应,能继续损伤细胞膜甚至整个细胞。此外,膜脂质经磷脂酶A2作用后生成的花生四烯酸也可被过氧亚硝基阴离子(ONOO-)氧化,导致细胞膜功能障碍和结构损伤。脂质过氧化通过链式和链式支链反应,放大ROS的作用,一个ROS能导致很多脂质分解产物的形成。在这些分解产物中,一些是无害的,另一些则能引起细胞代谢和功能障碍,甚至死亡。

精子膜的脂质过氧化反应引起膜PUFA受到破坏,使膜的流动性下降和膜的通透性增加,而精子膜的流动性是精子行使其功能的重要保证,并且与膜功能密切相关的离子泵的功能也受到影响,导致ATP的产生下降,精子运动能力减弱甚至丧失;高水平的ROS会破坏精子的顶体反应,影响精子与卵细胞膜融合的能力。膜的通透性增加使正常不能透过膜的物质(如Ca2+)通透性增加。而且膜中蛋白质的聚集和交联会使酶的活性发生改变,导致膜受体失活。

脂质过氧化的终产物是丙二醛(malondialdehyde,MDA),能间接的反映脂质过氧化程度。

精子活力的损伤

精子的运动能力是衡量精子功能的重要指标。ROS水平增高与精子的活力成负相关性。在自然受精过程中,精子必须具备一定的动力,否则很难经过宫颈、子宫、输卵管到达受精部位。如前所述精子膜的过氧化损伤会引起ATP产生下降,精子动力来源减少,活力下降。而且,H2O2能透过精子膜,抑制细胞内酶的活性,如糖代谢的关键酶——6-磷酸葡萄糖脱氢酶,进而影响细胞内NADPH的活性,同时氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽积聚,使精子内部产能下降的同时,也能导致精子细胞膜磷脂的过氧化,精子抗氧化防御功能下降。

最近研究证实,精子尾部蛋白酪氨酸基团磷酸化可能是精子产生运动的机制之一。此外,精子运动除与ATP合成酶类有关外,还与促进精液液化、果糖分解等酶类有关。ROS可使酪氨酸、色氨酸、鸟氨酸等硝基化或羟化,使巯基氧化,导致生殖系统中使精子蛋白酪氨酸磷酸化-去磷酸化作用的一些酶,及上述与精子运动有关的许多重要的酶被抑制、灭活以及活性部位破坏,最终使精子的运动能力下降。

精子DNA的损伤

一般情况下,有生育力男性精子DNA损伤低于10%,而不育男性精子DNA损伤可达25%。新近报道认为,约有20%不育男性精子DNA的损伤大于30%。夫妻双方中,假如男性精子DNA的变性超过30%,自然受孕的机会就会大幅度下降。即使妊娠,其流产发生率也会大大增加。精子DNA完整性被认为是一个独立的预测精子质量指标,在体内和体外都比常规检测价值的指标有更好的诊断和预测价值。

正常情况下,精子DNA紧密包装和精浆的抗氧化物质都使精子DNA免受氧化损伤。精子核占精子头部65%,包含父方的遗传物质。精子发生过程中,各期生精细胞核内DNA的含量发生规律性的变化,精子发生过程中经历精原细胞、精母细胞、精子细胞和精子几个阶段。在精子细胞阶段,细胞核内DNA结合的组蛋白大部分转化为精核蛋白,形成高浓度的DNA精核蛋白复合物。成熟精子核内DNA与精核蛋白紧密结合,高度浓缩,抑制异常基因的表达,使遗传物质保持稳定。精子进入附睾后,精子在附睾成熟过程中,精核蛋白中大量的巯基(—SH)不断氧化成二硫键(―S―S)与DNA更紧密的结合,使DNA更具有抗酸能力,维持了双链结构的稳定。而且,精子核的成熟度直接影响精子受精能力和受精原核的形成。

研究显示不育男性精液中高水平的ROS与DNA的碎片增多存在很大的关系。高水平的ROS影响精子细胞核中DNA的完整性。不育男性精子DNA碎片明显增多。当精子暴露于人为的ROS环境中,会造成精子DNA的氧化修饰、DNA链的断裂、交联、片断的氧化、产生游离的片断,造成缺失、DNA的染色质的重组。氧化应激(OS)与DNA链的断裂有密切的关系。

而且,精子精核蛋白的缺乏将影响精子核的致密性,会造成精子在受精时发生去聚合的功能失调。精子DNA进入胞质后不能去浓缩,受精将会失败,即使受精也会影响胚胎的质量。另外,DNA损伤的程度也会影响夫妻自然受孕的情况。因此精子DNA损伤程度与妊娠失败率增加有关,这可能是许多不明原因不育的原因之一。

精子线粒体损伤

线粒体是提供精子运动的能量源泉,其含有较大量的PUFA和血红素酶复合体,对包括ROS在内的各种损伤因子也极为敏感。因为线粒体内膜上载有呼吸链及产生ATP的酶系,ROS引起线粒体损伤导致的危害更大。

目前认为ROS造成线粒体损伤主要为:

  1. 引起线粒体膜脂质过氧化改变,引起线粒体内膜上呼吸链及ATP的酶系功能异常;
  2. ROS可使含有巯基的酶失活,线粒体内与ATP生成有关的酶活性改变;
  3. 损伤线粒体DNA(mtDNA):精子mtDNA是独立于细胞核染色体外的基因组,具有自我复制、转录和编码功能。mtDNA是裸露的DNA,缺少组蛋白和DNA结合蛋白的保护,易受ROS的攻击;而且,mtDNA本身修复损伤的能力较低,因而精子线粒体中产生的ROS易造成精子mtDNA氧化损伤。ROS引起的精子mtDNA改变将破坏mtDNA编码蛋白的合成,而这些蛋白是线粒体呼吸功能所必需的,影响线粒体能量的产生;
  4. 诱导线粒体Ca2+释放:ROS在线粒体内可通过酶促和非酶促反应,引起NAD(P)H的氧化还原状态发生改变,即NAD(P)H氧化状态比例增高,氧化态的NAD(P)H可被位于线粒体内的一种吡啶核苷酸酶分解为尼克酰胺及ADP-核糖基。后者又可使线粒体内膜上的一种蛋白发生糖基化,激活线粒体膜上钙通道,使钙从线粒体内释放出来。线粒体的膜电位减小,内膜通透性增强,造成膜损伤,线粒体功能障碍,严重者导致精子细胞损伤乃至死亡。

精子蛋白质的过氧化作用

就蛋白质而言,位点特异性损伤理论认为O2-•通过歧化反应生成H2O2,其经蛋白质结合的金属催化,在结合处形成•OH,•OH是ROS诱导生物损伤最重要的成分,由于其高反应性和短的扩散距离而使得生物大分子是它最常攻击的目标。•OH与最邻近的氨基酸反应,生成蛋白氢过氧化物。蛋白氢过氧化物是蛋白质与ROS相互作用的主要产物。蛋白质氢过氧化物在过渡金属离子的催化下,产生的蛋白自由基能引发支链反应不断生成蛋白氢过氧化物,扩大蛋白质的损伤。蛋白氢过氧化物及其裂解产物能交联成聚合物或裂解产生众多的新的自由基中间物,由此生成新的损伤源。蛋白质过氧化对蛋白质包括酶本身就是一种损伤,能造成蛋白质主链氧化、蛋白质的断裂,还能造成氨基酸的侧链氧化,形成体内氧化蛋白的积聚。蛋白氢过氧化物还能与谷胱甘肽和维生素C反应,造成它们在体内的耗损,由此降低机体的抗氧化能力,而且能改变细胞的氧化还原状态,影响基因激活。

蛋白质过氧化,受到氧化的蛋白质通常失去功能活性,氧化蛋白的伸展增加了它对蛋白质酶的敏感性,但是蛋白的交联影响了蛋白酶对它的水解作用,可见上述种种反应的发生,最终导致细胞和机体正常生理功能的障碍。

OS与精子的凋亡

ROS造成精子的一系列损伤,最终能导致精子的凋亡。生理情况下,凋亡是一个自然的过程,它能去除体内衰老的细胞,又叫程序性死亡。在人类的生殖系统,凋亡能去除异常的生殖细胞,多种外在的和内在的机制控制着凋亡的过程。研究发现ROS的水平与细胞凋亡存在正相关性,凋亡基因及其蛋白与ROS的水平存在关联。实验发现,精子与H2O2一起孵育,就能诱发精子的凋亡,造成有效精子浓度下降。

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