精子发生过程中的基因表达(时空变化、调控)

精子发生表现为生精细胞的多阶段的增殖与分化,最终形成有精子的生理过程,在这个过程中,基因的时空表达及调控起着至关重要的作用。精子发生就其本质而言,是在严密完整的调节网络(包括内分泌和局部因素等)调控下,特异基因在特定的时空秩序上,精密有序的表达和相互作用的结果。精子发生过程中,大量基因呈现阶段特异性启动或高表达,这些基因的作用至少体现在两个很重要的方面:

  1. 很多基因的产物是完成精子发生过程所必需的,如发生减数分裂、DNA修复、甲基化与去甲基化,等等。实验已经发现,如果一些必需的基因得不到正常的表达,精子发生就不能维持和继续。
  2. 在精子发生过程中,很多精子结构和功能密切相关基因得以表达,这些基因在精子复杂的功能中起着重要的作用。通过基因敲除等实验,已表明与精子发生和精子功能密切相关,导致男性不育病因的基因有400余个。

近年来,研究表明另外两种小RNA,即microRNA和piRNA,在精子发生过程中起着必要的作用,也可能部分呈现阶段特异性表达模式。但目前关于这些小RNA在精子发生中表达的阶段性和表达调控研究较少,对于小RNA在精子发生中的作用请见本章第六节。本节主要介绍蛋白编码基因的表达调控。

精子发生过程中的基因表达的时空变化

对于精子发生过程中基因阶段性表达的了解始于动物实验研究,尤其近年来,由于基因组学技术的发展和应用,使全面了解精子发生过程中基因表达谱的时空变化成为可能。在小鼠睾丸发育过程中或各阶段生精细胞基因表达谱的结果有力而全面地表明,精子发生各增殖分化阶段都有其特定种类和水平的基因表达。

对于人类,虽然不能通过对正常人睾丸组织研究得到阶段特异表达基因谱,但是临床上非梗阻性无精子症患者的活检组织却为这方面的研究提供可能。因为人类非梗阻性无精子症睾丸组织有不同病理类型,也就是精子发生停滞于不同增殖分化阶段的表现,所以,可以用于研究人精子发生各增殖分化阶段的基因表达谱。近期,Cappallo-Obermann通过表达谱芯片分析非梗阻性无精子症患者(唯支持细胞综合征、精子发生阻滞和精子发生低下)睾丸组织的基因表达,找出了约2500个在睾丸特异表达的基因,而这些基因有很多在不同类型的无精子症患者的睾丸中有明显的表达差异,表明这些基因在精子发生的不同阶段高表达。von Kopylow则通过表达谱芯片分析了完全性唯支持细胞综合征(睾丸无精原细胞)和非完全性唯支持细胞综合征(睾丸有少量精原细胞)睾丸组织基因表达差异,得到200多个精原细胞特异性标识的候选基因。

精子发生过程中基因表达的调控

精子发生过程中基因表达的调控复杂,有着与其他生理过程不同的调控特点,主要调控包括以下方面。

转录因子

一、受体家族

1)性激素受体家族:性激素能与性激素受体结合后,受体进入细胞核,作用于DNA的反应元件,启动基因转录。研究表明,在一些精子发生中启动表达基因的启动子区域含有类固醇反应元件(steroid response element,SRE),即5′-GGTACAnnnTGTTCT-3′,这个序列可以与雄激素受体、孕激素受体、糖皮质激素受体等结合而启动基因表达,而5′-AGGTCAnnnTGACCT-3′仅与雌激素受体结合。当然,在精子发生过程中主要起作用的性激素是雄激素,目前也在Pem基因上发现了新的雄激素反应元件(androgen response element,ARE),包括5′-AGATCTcattcTGTTCC-3′和5′-AGCACAtcgTGCTCA-3′。

2)维甲酸受体家族:视黄酸受体(retinoic acid receptor,RAR)和视黄醇类受体(retinoid X receptor,RXR)是维甲酸受体家族在睾丸中发现的成员。维生素A缺乏的雄性大鼠表现为不育,RARα或RXRβ基因敲除雄性小鼠表现为精子发生障碍,表明这些受体在精子发生中的重要作用。与RAR和RXR结合的DNA序列被称为视黄酸反应元件(retinoic acid response element,RARE)和视黄醇类反应元件(retinoid X response element,RXRE),序列分别为5′-AGGTCAnnnnnAGGTCA-3′和5′-AGGTCAnAGGTCA-3′。

3)孤儿受体(orphan receptor)家族:生殖细胞核因子(germ cell nuclear factor,GCNF)属于核受体超家族成员,是一个孤儿受体,相应DNA结合序列包括:(AGGTCA)重复序列和半重复序列,如TCAAGGTCA等。在睾丸中有两种转录本,大小分别为7.4kb和2.3kb,前者主要在睾丸发育过程中和粗线期精母细胞中表达,而后者主要存在于圆形精子细胞。目前,已发现受GCNF调控表达的基因,如精核蛋白1和精核蛋白2基因。睾丸中还存在其他孤儿受体,如睾丸孤儿受体2(testicular orphan receptor 2,TR2)和睾丸孤儿受体4(testicular orphan receptor 4,TR4)等。

二、其他转录因子

1)热休克因子:包括热休克因子1和2(heat-shock gene activator,HSF),HSF2表达呈连续稳定表达,在睾丸组织中主要存在于粗线期精母细胞和圆形精子细胞中。Hsf2基因敲除雄性小鼠生育力降低,粗线期精母细胞凋亡增加,精子和精子细胞数量下降。近期进一步研究表明,HSF2可与小鼠Y染色体结合,其中有些位点是在精子发生过程中启动表达的基因。

2)亮氨酸拉链家族转录因子:该在睾丸中起重要作用的包括cAMP反应元件调节物(cAMP response element modulator,CREM)、cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)、激活转录因子1(activating transcription factor 1,ATF1)等。这些因子的共同点是在亮氨酸拉链结构附近都含有与DNA结合的区域,在cAMP信号作用下,与相应的cAMP反应元件(cAMP response element,CRE)结合,调控基因转录。CRE基本序列为5′-TGACGTCA-3′。

3)Homeobox家族转录因子:这个家族庞大,又可以根据所含有的保守的同源序列分成亚家族。例如,小鼠Rhox(reproductive homeobox on the X chromosome)基因家族有30多个成员,并且在出生后的主要表达于生殖系统,所以,很可能在生殖中起重要作用,但是目前这个家族大部分成员的功能尚不清楚。近期对于Rhox5敲除小鼠的研究表明,Rhox5敲除后生精细胞凋亡增加,精子功能受损,生育力低下。

4)锌指蛋白家族转录因子:这个家族也有很多成员,OVOL1敲除小鼠睾丸细胞分裂障碍,约半数的精母细胞到达粗线晚期后即发生凋亡。WT1在睾丸中表达于支持细胞,利用条件型敲除WT1后,表现为睾丸发育异常,睾丸体积很小,生精小管发育异常;而用RNAi干扰WT1则导致支持细胞和精子细胞之间的连接结构发生异常,同时,一些基因的转录受到影响。

5)其他转录因子家族:如GATA家族、NF-κB家族、Y-Box家族(结合序列5′-CTGATTGGYYUU-3′)等。

另外,一些一般的转录因子,也就是在很多细胞中都普遍存在并起作用的转录因子,也同样在精子发生中起作用。而且,这些转录因子的水平和调节也是调控精子发生过程中基因有序时空表达的重要方面。例如,TBP(TATA-binding protein)在早期单倍体精子细胞中的含量是一般体细胞(如肝细胞)的上百倍,这使得在精子形成前转录足够的mRNAs。

表观遗传修饰

表观遗传修饰也是基因表达调控的重要方面,详细请见本章第六节。

RNA结合蛋白

mRNA被转录后,其稳定性或是否被转录也是影响基因表达效率和时空变化的重要方面。另一方面,在精子形成过程中,mRNA的转录和翻译存在着很大的时间差异,mRNA的转录在圆形精子细胞发生变态和形成精子之前就停止了,而在精子形成的整个过程中,却有很多mRNA被翻译。

RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)在这些环节起着重要作用,其作用方式一般被认为是:在mRNA被转录后即被RBP结合,在mRNA被转导出细胞核后,可能更换其他的RBP,或仍然被原来的RBP结合。RBP的结合不仅仅是增加了mRNA的稳定性,所结合的RBP种类也决定了mRNA出核后的命运:是立即被翻译,还是暂时储存。

目前已发现了多种在精子发生过程中起作用的RBP,一般认为,这些RBP是结合到mRNA的非转录区域。RBP与mRNA的结合可以有序列的特异性,也有些RBP与mRNA的结合没有特异性。

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