精子发生的表观遗传学调控

表观遗传学(Epigenetics)是研究基因DNA序列不发生改变的情况下,基因表达了可遗传的变化的一门遗传学分支学科。基因的DNA序列基因在决定生命过程中所需要的各种蛋白质,决定生命体的表型起了基本的作用,但是并不是所有的作用。有很多的生命现象和生理病理过程并不能用经典的遗传学理论来解释,例如,同卵双生的两个人具有完全相同的基因组,在同样的环境中长大后,他们在性格、健康等方面会有较大的差异;有些表型特征只是由一个亲本的基因来决定,而源自另一亲本的基因却保持“沉默”。这些说明,在相应的基因碱基序列没有发生变化的情况下,一些生物体的表型却发生了改变,这些方面很多都可以在表观遗传学中找到答案和思路。表观遗传学范围很广,包括DNA修饰(如甲基化)、组蛋白修饰(如甲基化和乙酰化)、染色质重构、非编码RNA等,在本章中主要介绍DNA甲基化、组蛋白修饰、microRNA和piRNA在精子发生中的作用。

精子发生中的表观遗传调控方式

DNA甲基化

为研究最多的表观遗传修饰之一,DNA甲基化过程是指转运一个甲基基团至CpG双核苷酸胞嘧啶5′位置碳原子上。在基因组所有CpG序列中有大约60%~90%出现甲基化,未甲基化的CpG双核苷酸主要成簇分布于启动子区CpG富集的序列,称为CpG岛,启动子区DNA甲基化参与基因沉默,DNA甲基化也参与逆转录转座子和印记基因沉默。DNA甲基化由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)家族来完成,在小鼠中,有四种DNMTs:DNMT1、DNMT2、DNMT3A和DNMT3B。DNMT3A 和DNMT3B功能为重新建立新的甲基化模式,DNMT1用于维持已存在的甲基化模式,DNMT2在人类发现可使RNA甲基化,在小鼠是否有类似作用还不清楚。在人、小鼠及其他物种中,均含有一种与DNMT紧密相关蛋白DNMT3L,DNMT3L缺乏催化结构域,但是可以与DNMT3A和DNMT3B结合,体外及体内实验研究表明,DNMT3L有利于提高新合成的DNMT3A活性,虽然体外实验显示DNMT3L可与DNMT3B相互作用,但是缺乏证据显示DNMT3L可促进DNMT3B活性提高。

组蛋白修饰

在细胞有丝分裂及精子发生过程中,组蛋白修饰显得必不可少。他们帮助异染色质凝集或常染色质开放形成,组蛋白由球形结构域和延伸的氨基末端(称为组蛋白尾部)组成,组蛋白尾部的残基可被甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化和sumoylation。这些翻译后修饰(post-translational modifications,PTMs)能够改变染色质结构从而使基因被激活或抑制。

一、甲基化

是最常见的组蛋白修饰之一,目前已知组蛋白N末端有一些精氨酸和赖氨酸残基可被甲基化。组蛋白甲基化受组蛋白甲基转移酶(histone methyltransferases,HMTases)调节,组蛋白精氨酸甲基化参与了基因的激活和沉默,赖氨酸残基可被单甲基化、双甲基化及三甲基化,在精子发生过程中与基因转录和沉默相关。组蛋白去甲基酶调节精氨酸和赖氨酸甲基基团的清除,参与基因转录和沉默。在精子发生过程中,HMTases抑制剂SUV39H1(suppressor of variegation 3-9homolog 1)和SUV39H2、组蛋白H3和H4的甲基化、组蛋白H3的去甲基化起关键性作用。

二、乙酰化

组蛋白乙酰基转移酶(Histone acetyltransferases,HATs)能乙酰化核心组蛋白N末端特异赖氨酸残基,参与基因激活,组蛋白去乙酰基转移酶与HATs功能相反,与基因抑制相关。在精母细胞减数分裂过程中,组蛋白H3赖氨酸9、14、18、23位点和H4赖氨酸5、8、12、16等位点赖氨酸残基的乙酰化和去乙酰化尤其重要。

三、磷酸化

组蛋白磷酸化通常发生在所有组蛋白的几个丝氨酸残基,通常与基因转录激活有关,也有例外情况,如组蛋白异构体H2AX磷酸化(形成γH2AX)在精母细胞减数分裂时参与染色质的凝聚和基因沉默。

四、泛素化

组蛋白特异赖氨酸残基泛素化能促进或抑制基因转录,泛素化是指将泛素单体与赖氨酸残基共价结合的一种蛋白修饰,组蛋白H2A能被单泛素化,在精母细胞减数分裂时出现与转录抑制相关;相反,H2B单泛素化与转录激活相关。

五、sumoylation

组蛋白赖氨酸残基也可被小泛素相关修饰剂(ubiquitin-related modifier,SUMO)修饰,与抑制基因表达相关。sumoylation将小泛素相关修饰剂蛋白共价连接到组蛋白赖氨酸残基,一般防止PTMs激活,如乙酰化。已发现四种SUMO蛋白(SUMO1~4),目前只发现SUMO1与精子发生相关,在减数分裂过程中沉默XY小体(XY body)。

microRNA、piRNA与精子发生

近年来,在多种植物和动物中发现了不同数量的小RNA,其特定的表达模式及不同程度的序列保守性提示这些小RNA具有较为重要的生物学功能。目前已确定microRNA具有确切的基因表达调控作用,其主要作用机制是与Argonaut家族的AGO亚家族蛋白结合,通过与RNA干扰类似的途径降解mRNA。2006年,4个研究小组在哺乳动物的睾丸内发现了一类新的小RNA,因能与PIWI亚家族蛋白结合,故命名为piRNA(piwi-interfering RNA),认为其在精子发生中起重要作用。

一、microRNA与精子发生

miRNA是一类内源性的小分子非编码单链RNA,长度约为22nt,首先由Lee等在秀丽隐杆线虫中发现。他是由70~90nt、具有发夹结构的单链RNA前体(pre-microRNA)经过Dicer酶加工而成,主要通过与靶基因不完全互补结合,进而抑制翻译或促进mRNA聚腺苷酸尾巴的去除等方式调控靶基因的表达。

Argonaut家族蛋白是与microRNA、piRNA形成功能复合体的基本组成成员之一,在生物物种中高度保守。Argonaut家族蛋白分两个亚家族:AGO亚家族,包括AGO1、AGO2、AGO3、AGO4 4个成员,与microRNA结合形成核蛋白核糖体,分布广泛;另一个是PIWI亚家族,包括PIWI和AUB蛋白,均特异性分布于生殖细胞,被认为主要与piRNA结合,并在精子发生过程中起重要作用。

虽然microRNA在精子发生中具体的基因调节网络及作用尚不明了,但是诸多的研究表明,microRNA在精子发生中起着必要的作用:首先,哺乳动物的睾丸组织中含有大量的microRNA,也包括一些睾丸特异性的microRNA。而且,这些microRNA在精子发生过程中呈阶段性时空变化。例如,很多microRNA在未成年与成年哺乳动物(如小鼠、猪、猴子等)的睾丸组织中存在种类和量的差异;miR-17-92簇和miR-290-295簇在精原细胞中高表达,并且有可能在精原干细胞的增殖和分化中起调控作用;miR-122a、miR-34b和miR-34c主要表达于精子发生的晚期阶段,表明这些miRNA可能在减数分裂后的精子细胞中起调控作用。

近年来,对于microRNA在精子发生中的调控机制也有了一些突破,如最近Yu等研究证明miR-122a通过抑制转录蛋白2(Tnp2)的表达,在减数分裂后的精子细胞中起调控作用;Novotny等人发现miR-17-5p在睾丸精子形成过程中不断上调,通过抑制E2F1使生精细胞免受凋亡,利于正常精子的形成;miR-34c通过直接下调TGIF2和NOTCH2,从而在精子发生的晚期阶段起调控作用;miR-18通过作用于热休克转录因子2(HSF2)以利于精子发生的正常进行。由于miRNA进化的高度保守性,因此上面提到的miRNA及其调控机制有可能在人类精子细胞发生过程中也起到类似的作用。

二、piRNA与精子发生

PIWI亚家族的发现及其在精子发生中的作用先于piRNA,相应成员已在小鼠(MIWI,MIL1)、大鼠(RIWI)、人类(HIWI,HIL1)等睾丸组织中以及斑马鱼(ZIWI)的睾丸及卵巢发现。由于这种生殖细胞表达的特异性,尤其是哺乳动物睾丸表达的特异性,对PIWI亚家族蛋白功能的研究主要集中于精子发生中的作用。MILl和MIWI出现在小鼠精子发生的不同阶段:MILI存在于从精原细胞到粗线期精母细胞阶段的生殖细胞中,MIWI存在于从粗线期精母细胞到圆形精子细胞阶段的生殖细胞中。敲除mili基因,小鼠精子发生停滞于早期——粗线期精母细胞;敲除miwi基因,小鼠精子发生则停滞于圆形精子细胞阶段。AUB蛋白缺失可导致果蝇异常的精母细胞和圆形精子细胞发育。以上实验资料均支持PIWI亚家族蛋白在精子发生中尤其是减数分裂过程中起重要作用,目前认为,通过与piRNA结合在精子发生中起必要的调节作用至少是这个家族作用的一个主要方面。

piRNA是特异性存在于生殖细胞的一类小RNA,具有以下一些特点:①相对恒定的长度:26~31nt,较microRNA稍长。②特定的染色体分布:piRNA主要分布于第17、5、2号染色体,在1、3、16、19、x号染色体上分布很少。piRNA的保守分布,提示其功能与这些染色体上的基因组功能相关。③分析piRNA逆转录得到的cDNA序列,发现是源于以前那些被认为不会发生转录的区域。④趋向于簇状分布:对哺乳动物piRNAs的基因组分析显示,粗线期piRNA不均匀分布于主要常染色体的100个不同部位,大小范围1~100kb。而早期——粗线期的piRNA分布广泛,约存在900多个簇,且似乎不与粗线期piRNAs重叠。⑤一个簇内的piRNA来源相同,提示他们有一个共同的转录前体;在有的piRNA簇内,两条piRNA链的方向截然不同,提示他们由中心增强子向不同方向转录形成。⑥与来自于dsRNA的microRNA不同,piRNA可能来自单链RNA(ssRNA)。同一个簇内的piRNA几乎全部从双链DNA中的一条转录而来。极少数的piRNA簇转录自两条DNA链,即便如此,正义DNA链与负义DNA链产生的piRNA之间相互分开,两段DNA之间间隔有几百个碱基对。⑦与其他小RNA一样,在piRNA的5端富集U碱基。⑧与miRNA相比,piRNA的原始序列保守性要相对差些。

目前认为,piRNA在精子发生中的主要作用是抑制转座因子,维持基因组的稳定性。转座因子通过剪切/逆转录和粘贴的方式,可以在基因组中移动位置,例如:①DNA转座子编码一种转座酶,这种酶进入细胞核后结合到转座子的两端,剪下转座子再插入到基因组的其他位置;②LTR(long terminal repeat)逆转录转座子编码整合酶和GAG蛋白,GAG蛋白可以捕获LTR逆转录转座子的mRNA并将其逆转录成DNA,再由整合酶将DNA整合到基因组中;③非LTR逆转录转座子的基本过程与LTR逆转录转座子相似,但是作用的酶及复合体等不同。过多的和不适当的转座因子活动会影响基因组的稳定性,而基因组的稳定性对于精子而言是非常重要的。而piRNA通过抑制这些转座因子的活动,对于维持基因组的稳定性起着必要的作用。以后的研究可能会发现PiRNA的其他功能。

精子发生中的表观遗传调控

精子发生表观遗传重要变化

精子发生时,基因组经历主要变化包括有丝分裂的复制更新,减数分裂的重组和染色体分离,减数分裂后染色质结构的凝聚和包装。精原干细胞有丝分裂更新可以确保精原干细胞分化能力及父源遗传物质来源,减数分裂重组及父源、母源配对染色体随机分离进入新的单倍体精子细胞,能够确保物种遗传的多样性,同时减数分裂后染色质特异性包装确保父源遗传信息安全传递给下一代。在精子发生连续过程中表观遗传关键变化包括四个方面:转座元件沉默、父系基因印记建立、减数分裂重组、减数分裂后染色质重组和凝聚。

精子发生重要表观遗传变化的调控

一、转座元件沉默

出生前,睾丸唯一的生殖细胞是生殖母细胞(gonocyte),生殖母细胞增殖一段时间后停滞。出生后不久生殖母细胞迁移至生精小管基底膜形成精原细胞并恢复增殖功能。精原细胞经过有丝分裂分化并形成精原干细胞池以参与减数分裂和精子形成过程。精子发生前转座子沉默主要发生在生殖母细胞和前精原细胞。转座元件是一段段移动的DNA,包括DNA转座子、含长末端重复序列的逆转录转座子、长的散在分布核元件(long interspersed nuclear elements,LINEs)和短的散在分布核元件。转座元件存在于45%人DNA和37%小鼠DNA。如果不对这些转座元件进行甲基化沉默,他们的移动可引起遗传突变、染色体断裂、异常的基因重组和基因重排。转座元件也可通过扩增或重新插入基因组引起基因异位表达或沉默。通常情况下,转座元件在生殖母细胞阶段通过DNA甲基化沉默转座元件阻止其扩散传播。DNMT3L可促进睾丸转座元件甲基化,从而起到沉默转座元件的作用。如果DNMT3L缺失,可引起LINE-1和池内A颗粒(intracisternal A-particle,IAP)转座子甲基化作用丢失。DNMT3L在生殖母细胞表达时间与DNMT3L沉默转座子的功能相符,DNMT3L在小鼠交配后14~18d胚胎生殖母细胞表达,这一时间正好与小鼠生殖母细胞全面开始甲基化时间一致。而且,DNMT3L敲除后小鼠转座元件沉默的缺失直接引起成年小鼠减数分裂停滞和不育。

二、父系基因印记建立

父系印记基因是指单等位基因表达的基因,其表达只存在于母系遗传的等位基因,在雄性生殖细胞中父系印记基因发生甲基化和沉默。印记基因须符合下面三个条件,首先父源和母源等位基因差异性DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传信息能够在细胞世代连续传递;其次等位基因表观遗传信息在生殖细胞发育时可以擦除并根据性别不同进行重建;最后,等位基因表观遗传信息在受精后胚胎发育体细胞中被继续保留,不能被擦除。

在小鼠,父系印记基因大约在交配15.5d后胚胎的生殖母细胞开始建立,一直持续到精原细胞形成。这种基因印记在精子发生后面阶段持续存在,直到进入精子传递给下一代。目前鉴定了3个父系印记基因区:H19-Igf2、Rasgrf和Dlk1-Gtl2,更多的母源印记基因已被鉴定。在雄性生殖细胞,BORIS(brother of the regulator of imprinted sites)因子、DNA甲基转移酶(DNMT3A,DNMT3B和DNMT3L)参与父源印记基因建立。DNMT3L缺失可引起父系印记基因区域甲基化的丢失,DNMT3A和DNMT3B敲除的精原细胞父系印记基因区域的甲基化模式发生变异。DNMT1在基因印记建立过程中也很重要,DNMT1缺陷的胚胎基因组的甲基化丢失,甲基化水平低于Dnmt1杂合子或野生型胚胎的30%;而且,在父系和母系印记基因区域中能观察到异常甲基化模式。建立合适的父系印记对后代自然遗传这一等位基因起决定性作用,近期有文献报道,对少精子症不育男性和精子正常男性7个印记基因甲基化水平进行检测,发现基因印记建立的异常可增加不育概率。

三、减数分裂重组

(1)减数分裂过程:

精原细胞经过分化和连续的有丝分裂周期产生初级精母细胞,然后进入减数分裂。减数分裂包括两次细胞分裂,染色体数目减半。在第一次分裂时,初级精母细胞DNA复制然后分裂变成次级精母细胞。第二次分裂时,次级精母细胞分裂变成圆形精子细胞。在小鼠,减数分裂时间大部分分布于第一次减数分裂前期,占据整个减数分裂时间的90%以上,持续大约三周时间。第一次分裂前期分为四个阶段:细线期、偶线期、粗线期和双线期。在减数分裂的细线期,染色体开始浓缩并开始形成双链断裂(double-strand breaks,DSBs),双链断裂形成是粗线期同源染色体重组必不可少的;偶线期,姐妹染色单体开始配对形成联会复合体(synaptonemal complexes,SCs),联会复合体稳定同源染色体配对,同时协助同源染色体的非姐妹染色单体之间的交换和重组。在粗线期,同源染色体联会,同时进行非姐妹染色单体的交换和重组;进入双线期,同源染色体开始分离,SCs开始消失。第一次分裂前期完成后,初级精母细胞经过中期、后期和末期的分裂形成两个次级精母细胞。在中期,同源染色体进一步凝聚附着于纺锤体纤维。后期,同源染色体分离,但姐妹染色单体仍连接在一起向细胞两极移动。末期,纺锤体压缩,胞核和胞质开始分裂。次级精母细胞中含有单套染色体,但含有二倍体DNA含量。在第二次减数分裂时,染色体发生凝聚,次级精母细胞经过第二次减数分裂的前、中、后、末期。第二减数分裂过程中,姐妹染色单体分开,次级精母细胞分裂为圆形精子细胞,含有单倍体DNA含量。通过减数分裂,每个初级精母细胞最终形成四个单倍体的圆形精子细胞。减数分裂过程的很多方面受表观修饰精确调节。

(2)减数分裂的染色质重塑和甲基化:

一些研究表明,表观遗传修饰在减数分裂染色体包装、配对和重组的方面是必不可少的。DNMT3L促进雄性减数分裂过程中所需的甲基化模式建立。DNMT3L缺乏时,减数分裂染色体不能精确地形成异染色质导致同源染色体在减数分裂偶线期不能成功配对,细线期和偶线期精母细胞显示非同源联会以及精母细胞无法达到充分的粗线阶段,结果,所有的生殖细胞在偶线期和粗线期阶段凋亡或塌陷而死亡。有报道证实,在Dnmt3l基因敲除雄性小鼠中,甲基化的丢失导致在减数分裂期间形成不合适的常染色质状态以及应该表达抑制的基因继续被激活,包括基因印记区,逆转录转座子和重复元素的保持活跃,从而导致“减数分裂大灾难”。显然,精子发生减数分裂的进展需要DNMT3L介导的甲基化作用。

HMTases的SUV39H1和SUV39H2也参与雄性减数分裂表观遗传调控,SUV39H1在多种组织广泛表达,而SUV39H2主要在睾丸中表达。SUV39H1和SUV39H2负责染色体臂间异染色质区组蛋白3赖氨酸残基9(H3K9)上的三甲基化。H3K9的三甲基化(H3K9tri-methylation,H3K9me3)作用导致异染色质蛋白HP1α,Pβ和HP1γ的结合,随后与HMTase SUV420H、甲基转移酶DNMT3A/DNMT3B和二甲基化、三甲基化H4K20结合,从而引起异染色质区转录抑制。Suv39h缺陷小鼠显示精子发生过程受损,精母细胞由于在粗线期阶段同源染色体不完全配对和联会从而发生凋亡。

最近研究表明,参与体细胞中常染色质区H3K9单甲基化和双甲基化的HMTaseG9A,在雄性精母细胞减数分裂有重要作用。G9a的缺失,导致妊娠中期胚胎死亡,由于这个原因,产生特殊谱系生殖细胞限制性G9a基因敲除小鼠。这些小鼠不育,因为精母细胞减数分裂不能越过粗线期,许多精母细胞无法形成SCs,推测SC形成障碍可能是由于粗线期染色体无法找到同源染色体配对或G9A调节的基因过表达引起。

除了组蛋白修饰的动态变化,雄性减数分裂的完成还需要特异的组蛋白变异体。组蛋白变异体H2AX是减数分裂细胞核小体的重要组成部分。在减数分裂DNA双链断裂过程中,H2AX在丝氨酸残基Ser139处磷酸化,从而形成磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)。在减数分裂的常染色体中,γH2AX集中分布DSBs处,并参与细线期和偶线期精母细胞减数分裂重组时的染色质凝聚。有学者提出,γH2AX可能募集DNA修复结构的成分到DSB部位,一旦DSBs消失和联会形成,γH2AX不再是局限分布于DSB部位。

减数分裂过程中存在的其他DNA修复蛋白包括RAD50和RAD51。RAD50是第一个被募集到常染色体DSBs处的蛋白分子,并且从减数分裂前细线期到偶线期结束持续存在。在细线期,RAD51与轴向元件形成有关。RAD54是同源染色体基因片段重组和DNA修复所需的DNA依赖ATP酶。在DNA修复中,RAD54与RAD51相互作用,在同源重组时通过置换核小体而促进染色质重塑。泛素结合酶HR6B也参与DNA损伤修复,并在减数分裂同源染色体基因片段重组时参与染色质结构的调控。在Hr6b基因敲除小鼠,由于SCs的结构发生较大变化从而使精子发生受损。这些小鼠显示减数分裂重组的频率增加。

(3)减数分裂所致的性染色体失活(Meiotic sex chromosome inactivation,MSCI):

在减数分裂的粗线期阶段,X和Y染色体形成XY小体,或称为性小体(sex body),并在MSCI的过程中变得转录沉默。与常染色体不同,雄性性染色体是异源性的,仅在他们拟常染色区域联会。XY体的产生及其异染色质状态的维护,一直是最近研究的焦点。现在有大量的已知与MSCI相关的表观遗传修饰,但是其确切发生顺序尚不清楚。

当粗线期常染色体联会时,不管DSBs是否发生,γH2AX均募集到XY体。H2AX缺陷精母细胞无法在第一次减数分裂粗线期形成XY体,减数分裂在粗线期停滞。H2AX的磷酸化依赖于DNA修复蛋白ATR(Rad3related,ATR)。在MSCI开始时ATR被募集到XY体。ATR向XY体的募集依赖于乳腺癌肿瘤抑制蛋白1(the tumour suppressor protein breast cancer,BRCA1)。小鼠Brca1低表达的减数分裂细胞不发生H2AX磷酸化,粗线期初级精母细胞不经历MCSI。H2AX的磷酸化、ATR和BRCA1共同作用启动MSCI。这是MSCI过程中发生在XY体的最早的事件之一。

在整个粗线期为了维持MSCI,还有许多其他的发生在XY体上的表观遗传修饰。他们包括H2A的泛素化(形成uH2A),SUMO化(涉及SUMO1),H3K27甲基化,H3K9、H4K20、H3K79和H3K27二甲基化,H3K9和H4K20三甲基化,H3K9、H4K12和H4K16去乙酰化。参与基因激活的H4K5和H4K8超乙酰化也存在XY体上。然后,每一种表观遗传修饰各自执行的功能还不清楚。

当许多其他异染色质从XY体消失时,H2A变异体H2AZ的出现与粗线期后阶段初级精母细胞MSCI相关。在完成MSCI后,H2AZ整合到XY体,他被认为可部分保持非活动状态的圆形和长形精子细胞中的XY体失活状态。H3变异体H3.3也与MSCI相关,H3.3在MSCI期间被整合到XY体,同时组蛋白变异体H3.1和H3.2和大部分组蛋白PTMS丢失。丢失的PTMs,包括H3K4的单甲基化、双甲基化和三甲基化,H3K9的双甲基化和三甲基化,H3K27的单甲基化和双甲基化,H3K79的双甲基化,H4K20双甲基化和三甲基化。在减数分裂晚期和减数分裂之后,这些主要参与基因沉默的大量组蛋白修饰被选择重新获得。H3.3K9,K14和K18的乙酰化修饰参与基因激活。尽管已经清楚,在精子发生的MSCI晚期和减数分裂之后H3.3整合到XY体可促进广泛的染色质重塑和XY体基因沉默,但是H3.3 在MSCI中执行的确切作用尚不清楚。

此外,最近发现SCMH1在调节XY体的部分染色质修饰方面有重要作用。SCMH1是哺乳动物多梳抑制复合体1(polycomb repressive complex 1,PRC1)的一部分,参与大量基因的抑制。在睾丸内,SCMH1在偶线期、粗线期初级精母细胞和圆形精子细胞表达,参与XY体PRC1复合体排斥。最近Scmh1敲除小鼠实验证明,缺乏Scmh1导致精母细胞凋亡丢失,雄性生育力降低。Scmh1缺陷粗线期精母细胞不能维持XY体PRC1合成物排斥,导致XY体H3K27me3。这些结果表明SCMH1是一个关键的PRC1调节成分,维持XY体PRC1排斥。

四、精子形成

在减数分裂后期,单倍体的圆形精子细胞除了发生充分的胞质变形,还进行广泛的染色质重塑发育为成熟的精子。这一过程涉及细胞核重塑和凝聚以保护DNA,并使基因转录呈惰性状态,DSBs和组蛋白向精核蛋白的转换协助完成这一过程。

组蛋白向精核蛋白的转换是指组蛋白首先被转换核蛋白(transition nuclear proteins,TPs)取代,随后TPS被精核蛋白取代。组蛋白向精核蛋白的转换与组蛋白H4超乙酰化有关,H4超乙酰化促进核小体结构松散,便于去除组蛋白、整合TPs和随后的PRMs。

一些基因敲除的动物模型结果显示,组蛋白被TPs取代后随后被PRMs取代过程是精子形成所必须环节。缺乏TP1或TP2的小鼠,在精子形成期间染色质凝聚时有微弱异常,精子数目正常,并有生育力的。然而,TPs均缺乏的小鼠显示所有的生精细胞染色质凝聚不规则,许多生精细胞出现DNA断裂,PRM2翻译后不能加工处理,雄性小鼠不育。精核蛋白是仅在生精细胞发现的富含精氨酸和半胱氨酸的碱性小蛋白质。大多数哺乳动物产生两种精核蛋白的变异体,PRM1和PRM2,他们负责将DNA结构包装的非常紧凑。破坏PRM1或PRM2任一基因表达,会破坏精子细胞核形成、PRM2加工处理和精子功能,引起杂合子的后代雄性小鼠不育。精核蛋白在人类也很重要,精子中PRM2的缺乏或PRM1/PRM2的比例失调,与男性不育有关。

Jhdm2a基因敲除小鼠研究结果进一步证明了精核蛋白的重要性和其在生育中的调节作用。精核蛋白的表达部分受H3K9me2/H3K9me1脱甲基酶JHDM2A(JmjC-domain-containing histone demethylase 2A,JHDM2A)的调节。JHDM2A在初级精母细胞粗线期后段开始表达,持续到长形精细胞形成,精子中不表达JHDM2A。Jhdm2a敲除造成减数分裂以后染色质凝聚缺陷,包括精细胞核结构和延伸的异常。因此,Jhdm2a突变型雄性小鼠精子数目会减少,不能生育。JHDM2A能够作用于圆形精子细胞的Tnp1 和Prm1启动区,使单甲基化和双甲基化H3K9去甲基化。JHDM2A缺失会导致Tnp1和Prm1启动子超甲基化,从而引起TP1和PRM1的表达缺失,导致不育发生。

如上所述,TP和PRM功能,受表观遗传修饰的调节。钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅳ(CAMK4)对PRM2丝氨酸/苏氨酸的磷酸化作用的丢失可导致不育。Camk4敲除小鼠的生精细胞呈现PRM2的缺失和TP2停留时间的延长。因此,Camk4基因敲除的小鼠长形精子细胞大量减少,附睾中没有成熟的精子,从而引起不育。

除了组蛋白向精核蛋白转换,精子形成也依赖于H1连接组蛋白的变化。H1T2是H1变异体,特异地表达于圆形和长形精子细胞。H1T2基因敲除的雄性小鼠附睾精子形态异常,精子胞质滞留和能动性受损,无法生育或者生育能力严重低下。而且,精子PRM1和PRM2的表达降低,说明H1T2参与组蛋白向精核蛋白转换。

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