精子DNA甲基化分析

精子DNA甲基化研究的必要性

WHO调查结果显示,全球有10%~15%育龄夫妇出现不孕不育,其中由于男方原因约占50%。与女性不育很不同的是,大部分男性不育找不出病因而被诊断为特发性不育,可能存在目前未知的遗传因素(包括表观遗传学因素)有关。

精子基因组对生殖影响要远远超过精子数量和形态的简单评价,精子基因组结构不同、水平改变都可能影响精子生殖功能。目前,精子基因组异常包括:染色体非整倍体畸变、Y染色体微缺失、非特异性DNA链断裂、DNA甲基化表观遗传学改变,其中DNA甲基化表观遗传学变化与男性不育关系成为研究的热点,也为特发性不育男性病因学诊断带来了希望。使用表观遗传学异常DNA的精子可通过ICSI技术而受精,但不能解决损伤DNA对其他生殖参数影响,如胚胎发育、胚胎移植、妊娠失败、出生率、遗传性疾病发生率等。目前,已发现一些精子印记基因异常与遗传性疾病有关,如Angelman综合征、Beckwith-Wiedemann综合征。近年来,有研究报道精子发生过程中的基因甲基化异常与无精子症、少精子症、畸形精子症及少弱畸形精子症有关。因此,从男性不育病因及辅助生殖技术的安全性角度来看,精子DNA甲基化的研究和分析有着重要意义。

精子DNA甲基化水平检测的方法及特点

分析精子DNA甲基化的方法可粗略分为两类,一类是分析精子基因组整体甲基化,另一类是分析精子特异基因启动子区CpG岛的甲基化。精子整体甲基化水平分析,一般使用液相色谱法;精子特异基因甲基化检测有多种不同方法,以前研究时使用甲基化敏感限制性内切酶进行DNA消化,然后进行southern blot检测或PCR扩增;这一方法有一些缺点:

  1. 甲基化位点限制性酶切位点很少,仅能分析小于5%的甲基化位点;
  2. 需要提供大量DNA样本;
  3. 不能检测到部分甲基化的情况。

现在,常用的分析甲基化方法是基因组DNA序列经过重亚硫酸盐处理,然后进行甲基化特异性PCR扩增。简单来讲,基因组DNA经过重亚硫酸盐处理后,非甲基化胞嘧啶残基能够转化为尿嘧啶,CpG岛位点的甲基化胞嘧啶不发生转化,然后使用特异性引物进行扩增,扩增序列测序可以提供扩增序列每一个CpG双核苷酸甲基化状态。其好处在于能够提供一个确定DNA的甲基化胞嘧啶阳性结果和完整甲基化分布情况,而不是序列中一部分胞嘧啶甲基化鉴定。通过甲基化敏感单链构象分析(methylation-sensitive single-strand conformation analysis,SSCA)可获得甲基化半定量结果,这一方法是基于DNA重亚硫酸盐处理后PCR扩增的基础上发展而来。在这一方法中,DNA经过重亚硫酸盐处理,使用无CpG位点的引物进行PCR扩增,最后进行SSCA,确定目的基因甲基化的情况。

此外,实时PCR可以与重亚硫酸盐处理技术结合起来分析DNA甲基化情况,提供甲基化定量信息。实时PCR可以在96孔板高通量实时分析,省去扩增后步骤,减少污染风险和工作量。近年来,CpG岛微芯片已经用于鉴定基因组未知的甲基化热点区或甲基化CpG岛,这一技术使用与甲基化和非甲基化等位基因相对应的寡核苷酸为探针,附着在固体支持物上,和重亚硫酸盐处理后DNA进行杂交,根据处理DNA与不同等位基因甲基化和非甲基化探针杂交信号的强度来鉴定DNA甲基化情况。除此以外,还有很多研究DNMTs活性的方法。

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