mRNA表达分析不仅为各种组织中的基因转录方式提供了信息,而且为进一步分析用外源刺激(如激素)下表达的组织特异性机制以及其调控提供了方法。细胞中mRNA的量依赖于mRNA的稳定性和基因转录的速率,后两者都受许多因素的调控,大多数情况下转录调控受基因编码区的邻近DNA控制,而且调控基因的区域常常位于该基因编码区的上游(即5′侧翼)。

确定DNA序列是否为转录调控因子

短暂表达分析系统确定DNA序列是否为转录调控因子。为了确定一段DNA序列是否为真正的转录调控因子,可采用短暂表达分析系统。该系统以融合基因的应用为基础,分析DNA导入后48小时内的基因表达。融合基因通常由所要研究的启动子激活蛋白位点或增强子序列与报道分子合成的基因相连而组成,同时假定在各种条件下报道分子合成的量可以反映所插入的序列报道和(或)促进转录的能力。

首先从基因组中将假定的转录调控因子如启动子顺序分离,然后与载体上的报道基因连接。报道基因可以编码一种容易在细胞抽提物中测出的蛋白质,但它在正常情况下并不在细胞中产生。根据不同用途,有多种可供选择的报道基因,包括各种酶、荧光蛋白质和肽类激素等。例如,萤火虫荧光素基因产物可催化荧光素释放光,将1个含有荧光素基因的重组质粒经转染引入到细胞中,荧光酶的量则由连接上的启动子元件的活性所决定,这样,当细胞抽提物与荧光素及ATP孵育后,根据产生荧光的量可测出启动子的活性。

基因启动子分析

基因启动子分析

注:分离假定的DNA调控顺序后,将之与报道基因连接,然后转化细胞。分析转化细胞中报道基因的表达水平以评价该启动子的活性

报道基因系统确定基因调控区功能

在活体细胞中,基因的调控要远比这一系统复杂得多,1个基因转录的随机性还依赖于染色体结构、核小体的位置以及转录因子的数量和翻译后修饰等因素。1个基因的调节区可能与转录起始位置的上游或下游距离很远,而且调控还与基因结构的立体构象有关。此外,还有一些基因以基因簇方式存在,具有大量的调节元件。基因组可能被包装成不同的染色质构型,这种排列紧密的染色体结构可以区域性地阻断邻近转录活跃或处于转录平衡的基因。在这种情况下,染色质结构的重建是调节基因表达的必需过程。组织特异性或一般的反式作用因子和顺式作用调控顺序相互作用可以决定染色质结构重建,也能提高染色体结构周围的增强子效率,从而起到调节基因表达的作用。

人类生长激素基因簇由5个基因组成,排列是GH1-CSL-CSA-GH2-CSB,其中GH1编码生长激素,在垂体表达,其他4个与之高度相关的基因是CSL(绒毛膜生长泌乳激素样基因)与胚胎的生长激素合成有关,CSA和CSB都编码绒毛膜生长泌乳激素,这3个基因均在胎盘表达,GH2也在胎盘表达。现研究发现GH1适当表达所需的1个或多个元件,包括4个DNase Ⅰ高敏感性位点,称为位点控制区,其作用是改变染色质的结构,激活或关闭基因表达。转基因动物实验表明当这4个DNase Ⅰ高敏区按正常的基因组构型被转染小鼠时,它们能一起指导转基因小鼠上hGH1在垂体特异性表达,但将4个DNase Ⅰ高敏区分别转染时,可观察到的hGH1的表达,但表达水平失去控制和丧失了组织特异性。提示多个元件之间的协同作用是使GH1在垂体呈特异性的适当表达所必需的。

转基因动物是进行基因功能分析的有力工具

转基因动物的基本原理是将改造后的目的基因(或基因组片段)用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前胚胎细胞,然后将此受精卵(着床前胚胎细胞)再植入受体动物的输卵管或子宫中,使其发育成携带外源基因的转基因动物,通过对转基因和动物表型的关系分析,明确外源基因的功能,也可通过转入外源基因进行基因产品的生产。转基因动物在基因功能及结构研究、找寻新基因、建立人类疾病的动物模型及基因治疗动物模型和基因产品生物等方面有着广泛的应用。

转基因动物技术的出现是建立于对哺乳动物从单细胞受精卵及其后胚胎发育各阶段的深入了解,以及成熟的胚胎采集、胚胎体外培养、胚胎移植技术的基础上的。1980年,Gordon第1个报道将克隆的胸苷激酶基因注射到小鼠受精卵中,在该受精卵发育而来的小鼠组织细胞内检测到外源基因的整合,并将这些带有外源基因的小鼠称为转基因小鼠。1982年,Palmitler等将大鼠生长激素基因显微注射到小鼠受精卵内,由于生长激素的表达,培育得到体型较正常小鼠大1~2倍的“超级小鼠”,表明外源基因产物可以影响并改变小鼠的生理机制。从此各种转基因的技术不断发展和完善,转基因动物技术也得到了广泛的应用。

基因同源重组(homologous recombination)(又称基因打靶)是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组,并整合到预定位点上,从而改变细胞遗传特性的方法。根据重组后靶细胞的特征可分为两种类型。一是由于外源序列的引入或部分取代,靶基因的原有结构被破坏,即为基因敲除(gene knockout);二是靶基因的全部序列为新的基因所取代。传统的基因剔除技术在全身所有组织中剔除了某一基因,不具备组织特异性和可调控性,目前条件性基因剔除技术日益成熟,它采用打了就走(hit and run strategy)、标记-交换(tag and exchange strategy)和Cre-loxP重组系统(Cre-lox P recombina-tion system)等新的策略,可对特定细胞和组织中任一基因进行核苷酸水平上的精确、可调控性突变。从理论上讲,它可以按照人类设计,对复杂基因组进行定量、定点的修饰,从而定向改变细胞乃至整体的遗传结构和特征。

转基因动物的技术路线如下:①构建重组基因载体;②用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体细胞核内;③用选择培养基筛选已击中的细胞;④将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物,对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。

MicroRNA技术投入少而操作相对简单

用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现,反义和正义RNA都阻断了基因的表达,研究者们对这个结果百思不得其解。直到1998年,Andrew Fire的研究证明,在正义RNA也阻断了基因表达的试验中,真正起作用的是双链RNA。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。这种双链RNA对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰(RNA interference,RNAi)。随后的研究中发现,RNAi现象广泛存在于线虫、果蝇、斑马鱼、真菌以及植物等生物体内,这些生物体利用RNAi抵御病毒的感染,阻断基因的作用。RNAi能高效特异地阻断基因的表达,在线虫、果蝇体内,RNAi能达到基因沉默的效果。在小鼠和人的体外培养细胞中利用RNAi技术也成功阻断了基因的表达,实现了细胞水平的基因沉默。siRNA(small interfering RNAs)就是这种短片段双链RNA分子,能够以序列同源互补的mRNA为靶目标,降解特定的mRNA。RNAi的发现具有划时代的意义,它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制,而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具,极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程。现在越来越多的研究人员开始采用RNAi来研究生物体的基因表达。RNAi技术可广泛应用于包括功能基因组学、药物靶点筛选、细胞信号转导通路分析、疾病治疗等方面。

RNAi研究的一般技术路线

RNAi研究的一般技术路线

与传统的基因敲除等基因沉默技术相比,RNAi技术具有投入少、周期短、操作简单等优势。RNAi成功用于构建转基因动物模型的报道也日益增多,标志着RNAi将成为研究基因功能不可或缺的工具。不仅如此,RNAi技术还将成为研究细胞信号转导通路与基因治疗的新途径。近几年来,RNAi技术已经成为分子生物学研究领域的一把利剑。

最近,由Hans-Peter Vornlocher领导的研究组尝试用siRNA 来解决高胆固醇问题。研究组设计用一种siRNA 与apoB的RNA结合,并将1个单个的胆固醇分子附着在siRNA的一端。研究人员希望这种脂溶性胆固醇能够引导siRNA穿过细胞膜到达细胞质。之后,他们将这种分子注射到具有高胆固醇水平的小鼠血管中。实验结果好得出乎研究人员的意料:经修饰的抗apoB siRNA导致小鼠中胆固醇水平降低到与apoB基因敲除小鼠的水平一样低。这种方法能够将许多器官中的apoB蛋白表达水平降低50%。研究人员认为他们的这种胆固醇-siRNA传递系统的原理能够用于指导siRNA沉默一些致病基因。这项研究证明注射的siRNA能够用于疾病治疗。

非基因序列改变和组蛋白表观修饰功能

表观遗传学研究非基因序列改变和组蛋白表观修饰功能。内分泌常见病大多数是环境因素与遗传因素共同作用的结果,而表观遗传学(epigenetics)在调节环境致病因素中起非常重要作用。表观遗传学是与遗传学相对应的概念,遗传学是研究基因序列改变所致基因表达水平变化;而表观遗传学则研究非基因序列改变所致基因表达水平变化,是不涉及DNA序列变化但却表现为DNA甲基化谱、染色质结构状态和基因表达谱在细胞各代之间传递的遗传现象,表观遗传学的研究还涉及组蛋白的表观修饰与功能、染色质重塑、结构与功能、基因组印迹等方面。有关代谢记忆——高血糖与组蛋白甲基化研究结果提示高血糖可以引起组蛋白密码的变化、控制饮食能影响表观遗传学的表达、短暂的血糖升高促使持续的NF-κB p65基因表达增加,因此基因与环境的关系可以导致染色质的特异变化,而早期强化治疗控制血糖有长期的代谢记忆效应及减少并发症的发生。

最新的动物实验表明,长期的高脂饮食会影起小鼠的体细胞和精子表观遗传学变化,并遗传给下一代,使得实验鼠的下一代体内只能产生一半胰岛素,小鼠后代在进入青春期前,易罹患糖尿病,它们的血糖浓度比健康雄鼠的子代升高了2倍,如果此研究结果适用于人类身上,这就意味着男性必须维持健康的饮食及管理体重。这已不单是个人健康问题,也是为下一代着想。由此可知,表观遗传学将在内分泌代谢病研究及临床应用中起着越来越重要的作用。

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