分子生物学技术推测基因及其蛋白质结构和功能

分子生物学技术分析复杂基因组:现代分子分型技术主要包括质粒DNA图谱分析、限制性内切酶消化后的染色体DNA分析、核酸探针杂交、脉冲场凝胶电泳(PFGE)、PCR和多位点序列分析(MLST)技术、DNA序列分析、基因芯片和基因重组技术,综合应运与改良这些技术可对人类的复杂基因组和个体遗传差异进行系统的分析,寻找和发现致病基因以及药物敏感性的DNA序列,建立个体特异性的临床治疗方案。

分子生物学技术推测基因及其蛋白质结构和功能:

杂交技术

以杂交为基础的技术包括Northern杂交、S1核酸酶制图或RNase保护分析、消减克隆、DNA微阵列等技术。1977年建立的Northern杂交技术是基因表达分析的突破性成果。使用Northern技术,用标记的cDNA或RNA探针与RNA印迹杂交来研究mRNA转录物的表达方式。一般而言,从细胞或组织中分离到mRNA后,经过纯化,将RNA分子在变性琼脂糖凝胶上按其大小不同而分离开来,随后将凝胶上的RNA转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上,即Northern印迹。再用放射或荧光标记的DNA或RNA进行杂交和放射自显影。S1核酸酶作图法是用来自基因组DNA不同片段的标记或非标记RNA或DNA探针,在适宜条件下形成DNA/RNA杂交体,用S1核酸酶消化,通过凝胶电泳分析消化产物,即可获得有关mRNA结构的定量和定性结果。此外,前已述及的减数杂交cDNA所获得的cDNA差减文库的方法也是基因表达分析的手段之一。

PCR技术

从PCR技术基础上发展而来的反转录PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)及mRNA差异显示法(mRNA differential display,mRNA DD)是第二类基因表达分析技术。在某些情况下,所研究的mRNA只是很少量的转录物,这时可以采用更为敏感的RT-PCR来做基因表达分析。在RT-PCR方法中,RNA首先被反转录成cDNA,然后通过特异性mRNA差异显示法,此法具有简便、灵敏、高效和省时等优点。这种方法的主要应用范围是:

  1. 几乎可检测细胞表达的所有基因;
  2. 可同时比较多种细胞类型;
  3. 可同时展示所有差异;
  4. 可同时检测基因的上调和下调表达。

但它在实际应用中也存在一些问题,主要包括:

  1. 假阳性差异表达带过多;
  2. 检测全部mRNA工作量过大;
  3. 稀有mRNA检测水平有待提高;
  4. 无法进行定量研究;
  5. 基因的克隆受mRNA表达的时效性影响。

除了普通PCR的高灵敏性外,还具有可直接监测扩增中的荧光信号变化获得定量结果,精确性高;定量和扩增同步进行,克服了PCR的平台效应;只需加样时打开一次盖子,其后完全是闭管操作,降低了污染;不需PCR后处理;只需2~3小时便能获得数据;高通量,几个反应可同时进行等优点。RQ-PCR克服了传统定量PCR需后处理、存在假阳性污染、准确度不高,电泳所用染色剂EB为强烈致癌物质和需进行复杂的检测工作等不足。

RQ-PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。它在常规PCR基础上,添加了荧光染料或荧光探针。荧光染料能特异掺入DNA双链,发出荧光信号,而不掺入链中的染料分子不发出荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。荧光探针法是将荧光共振能量传递(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术应用于常规PCR中,在探针的5′端标记1个荧光报告基团(R),3′端标记1个淬灭基团(Q),两者可构成能量传递结构,即5′端荧光基团所发出的荧光可被淬灭基团吸收或抑制;当两者距离较远时,抑制作用消失,报告基团荧光信号增强,荧光监测系统可接收到荧光信号。

利用以上荧光产生原理,在PCR过程中,可以连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。当信号增强到某一阈值(PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,阈值的缺省设置为3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍)时,Ct值被记录下来。C代表循环数(cycles),t代表阈值(threshold),Ct值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值。这样,只要获得未知样品的Ct值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

DNA核苷酸顺序的技术

一个细胞或器官的基因表达方式决定了它的基本生物特性,对于原核细胞来说,通过全基因组测序即可推测其编码蛋白质的基因顺序,但真核生物因为其基因内部不仅包含外显子,而且还有内含子,在人类基因组中发生转录表达的序列(即基因)仅占总序列的3%~5%,对这一部分序列进行测定,即cDNA随机测序,加快了mRNA-编码顺序的发现和鉴定。已随机测序的cDNA称为表达顺序标志(expressed sequence tags,EST)。利用EST能在基因组顺序中鉴定出编码顺序(即基因表达顺序)。重叠的EST能构建重叠群(contig),能确定基因表达的完整的mRNA顺序。人类基因组测序的完成,EST数据库的产生将有助于将表达基因区与非表达区分辨开来。EST获得后,将之制成DNA芯片(DNA chip),使进一步对基因表达谱进行分析成为可能。