分子生物学与内分泌学

分子生物学技术推动着临床内分泌学迅速发展,由于分析基因表达和鉴定遗传改变的能力不断提高,内分泌学研究的焦点已发生转变。从前内分泌学着眼于激素分泌研究,现在的注意力已转向激素和激素受体基因的表达研究和疾病在分子水平上的变化。

激素是内分泌学研究的核心内容。对激素的研究从它的发现开始,到阐明激素作用及其调节机制,激素与疾病发病机制的关系,疾病的诊断,最后到设计新的药物或新的治疗方案来达到治愈疾病的目标。在内分泌研究的不断深化过程中,分子生物学正在并将继续起着举足轻重的作用。

分子生物学技术鉴定新激素

许多激素正逐渐被人们认识,有关激素的研究一直在向纵深发展。每当一个激素被发现,都为内分泌学科开拓一个新的研究领域。分子生物学技术的广泛应用,更使内分泌学的发展进入崭新的阶段。例如,日本的研究者于1993年从嗜铬细胞瘤中分离出一种能升高血小板cAMP的多肽,经过纯化和测序后将其命名为肾上腺髓质素(adrenomedullin,AM)。3个月后编码人的AM基因被测序,2年后人血清AM含量被测出(1~10pmol/L),而且AM的受体也被鉴定出来。AM基因有4个外显子和3个内含子,5′端带有TATA、CAAT和GC盒,在AM基因上还有可与激活蛋白(AP-2)的几个结合位点以及cAMP调节的增强子元件,前体中第95位至146位氨基酸残基水解后形成AM。AM基因在许多不同的组织表达,但在肾上腺髓质、腺垂体、胃、脑、肺、心、肾等表达水平较高,它不仅是肾上腺髓质和血管内皮细胞、血管平滑肌细胞合成分泌的一种循环激素,也是由血管内皮细胞C、血管平滑肌细胞和心肌分泌的一种局部激素,它可以自分泌、旁分泌和胞内分泌的方式发挥其作用。AM的各种作用被认为是与受体结合后产生的,AM的膜受体是一种受体相关修饰蛋白(receptor associated modifying protein),其作用可能是通过G蛋白耦联受体,激活腺苷环化酶、G蛋白、蛋白激酶,或通过NO介导,或丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)以及K+-ATP通道甚至c-fos表达等信号途径来发挥其生物作用。

分子生物学技术阐明激素作用原理

食物中的维生素D或经皮肤合成的维生素D进入人体血液循环后,经过肝脏、肾脏酶的转化,成为有生物活性的1,25-(OH)2D。细胞核内存在一种能与维生素D结合的蛋白质,进一步研究发现该蛋白质具有与类固醇激素受体相同的特性,它不仅对1,25-(OH)2D具有高亲和力,而且还能与DNA结合。但当时人们对1,25-(OH)2D结合蛋白的性质仍不知晓。1988年,Baker克隆得到这一蛋白质的cDNA,确定了该蛋白质是维生素D受体(VDR),1,25-(OH)2D对靶细胞的不同生物作用,是通过结合VDR后再与靶细胞核的相互作用产生的。氨基酸序列分析表明,VDR属于包括甲状腺激素受体、肾上腺、性腺等分泌类固醇类激素受体在内的反式作用转录因子亚家族。Baker还利用克隆到的VDR cDNA在一个表达系统中制备出VDR,它与野生型VDR在物理特性及亲和力方面都没有区别。1997年,Miyamoto鉴定出VDR基因,并且通过分离跨越100kb以上的λ噬菌体和粘粒克隆重叠群鉴定出VDR基因的启动子。VDR基因含有11个外显子,长约75kb,VDR的5′端包含外显子1A、1B和1C,但VDR基因翻译产物由其他8个外显子(外显子2~9)编码,VDR基因的多态性与包括2型糖尿病、慢性肾衰竭继发性甲旁亢和骨质疏松等多种疾病密切相关。

VDR基因编码的VDR由427个氨基酸残基组成。VDR分为A、B、C、D、E5个结构域。其中C区是DNA结构域,称为DBD(DNA binding domain),由外显子2和3编码,其中含有9个高度保守的半胱氨酸残基,并含有2个锌指结构,N端的α螺旋具有指导VDR和DNA结合的大沟(major groove),C端的α螺旋提供VDR与伙伴蛋白(partner protein)形成二聚体互相作用时的交界面。VDR的E区与1,25-(OH)2D结合的LBD(ligand binding domain)区具有二聚化和反式激活能力,它与1,25-(OH)2D结合后,受后者诱导产生和表现出这些功能。此外,VDR的E区还具有激活功能称为AF-2。

1,25-(OH)2D与VDR结合对靶细胞的重要作用机制可以通过骨钙素基因启动子模型来阐明。亲脂性的1,25-(OH)2D通过细胞膜的脂质双层弥散到细胞核区,与VDR的LBD高亲和性结合。两者结合又引起VDR的构型改变,VDR分子表面打开并与视黄酸X受体(RXR)形成异源二聚体VDR-RXR,通过受体上的DBD两个锌指结构,该二聚体分别与靶基因上的维生素D受体作用元件(VDRE)结合。一旦与靶基因上的DNA结合,VDR-RXR异源二聚体征募其他共激活因子,形成VDR-RXR-共激活因子复合体与靶基因的转录器相互作用启动靶基因的转录。此外,共激活因子还可通过对靶基因上的组蛋白的作用而使染色质构型改变,促进转录过程,新转录翻译合成的蛋白质决定了靶细胞对1,25-(OH)2D的生理反应。在上述1,25-(OH)2D的作用机制中,任何一个途径的变化均可能引起1,25-(OH)2D作用的改变,甚至致病。同时,由于1,25-(OH)2D与核受体结合发挥生理作用是通过一系列基因转录而实现的,因而激素产生效应的时间较长。有学者研究发现,1,25-(OH)2D能使细胞内钙离子浓度瞬间升高,这不能用经典的核内受体结合机制来解释,从而使人们转向膜受体的研究。现已证实,1,25-(OH)2D的膜受体mVDR即膜联蛋白Ⅱ(annexinⅡ),它通过迅速地激活蛋白激酶C而发挥作用。

分子生物学技术探讨发病机制

遗传性低钙性维生素D抵抗性佝偻病(hereditary 1,25-dihydroxyvitamin D resistant rickets,HVDRR)是一种较少见的常染色体隐性遗传病。主要表现为低血钙、低血磷、继发性甲状旁腺功能亢进,血清1,25-(OH)2D水平显著升高,对维生素D治疗无效,但补钙有效。利用患者培养的皮肤成纤维细胞观察维生素D体系的变化,发现可按表型将患者分为两大类:一类患者具有正常的[3H]-1,25-(OH)2D结合能力,归为“受体阳性”或“配体结合阳性”类;另一类患者[3H]-1,25-(OH)2D结力能力减弱或消失,归为“受体阴性”或“配体结合阴性”类。

1988年,VDR的cDNA序列被阐明,因此使研究者们能有机会应用PCR对VDR DNA进行特异性扩增。Hughes等利用PCR扩增两个配体结合阳性家系的VDR基因的外显子,发现了在一个家系中VDR的第3个外显子有1个错义突变CGA→GAA,73位氨基酸从精氨酸突变为谷氨酸(Arg73Glu)。另一个家系中也存在错义突变GGC→GAC,33位甘氨酸变为门冬氨酸(Gly33Asp)。这两个家系中,患者的突变都是一样的,证实了HVDRR是隐性遗传病的推测。应用定点突变技术,把野生型VDR cDNA诱变为患者所带的VDR型突变,然后转染cos-1细胞,结果带有突变型VDR的cos-1细胞具有正常的[3H]-1,25-(OH)2D结合力,但与胸腺DNA结合的亲和力下降,与患者的细胞表型相符合,该表型产生的原因是由于外显子3编码的锌指结构点突变,导致1,25-(OH)2D与VDR的DBD结合缺陷。此外,应用骨钙素-氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因方法,显示CAT活性可被野生型VDR诱导,但突变VDR未能诱导CAT活性,进一步证明VDR的DBD的突变导致了HVDRR。至今已报道了HVDRR的DBD有8种错义突变。HVDRR的分子机制可概括为两个方面。对于配体结合阳性患者来说,突变可能影响了VDR与维生素D受体反应元件(VDRE)的结合而导致HVDRR。对配体结合阴性的HVDRR来说,已发现6种发生于VDR的配体结合区域LBD处的错义突变,这些突变导致VDR蛋白合成提前中止或由于VDR基因在外显子7~9缺失而使得对1,25-(OH)2D亲和力下降或干扰了RXR的二聚化而表现对1,25-(OH)2D的敏感性下降或敏感性丧失。

分子生物学技术研究激素调节机制

人们在很早时候就已经观察到大多数激素的调节是分级实现的,它们大多受控于下丘脑。首先,在下丘脑受到更高级中枢神经的刺激时,其神经内分泌细胞分泌下丘脑释放激素(或释放抑制激素),后者经血液传送到垂体,刺激或抑制垂体分泌各种垂体激素,垂体促激素随血液循环到达全身的靶腺,外周靶腺再分泌各自的激素,各级激素又可反馈作用于上级调控器官。这种激素调控系统一方面可使激素的作用放大,另一方面使之在体内维持一种稳态。这是激素在整体水平上的调节,但分子生物学的发展,使在分子水平上更深入地认识激素的调节机制成为可能。

葡萄糖浓度的变化可调节胰岛β细胞胰岛素释放。但胰岛细胞增生症(婴儿持续性高胰岛素血症低血糖症,PHHI)的低血糖不能反馈性抑制胰岛素分泌,低血糖时,血清中的胰岛素仍维持很高水平。用整体水平的激素调节机制不能解释。现在分子生物学研究已表明,胰岛β细胞中的ATP敏感性钾通道在葡萄糖代谢与胰岛素分泌之间起耦联作用。葡萄糖水平升高时,ATP/ADP的比值发生改变,关闭ATP敏感性钾通道,促进细胞Ca2+内流,从而胰岛β细胞内游离钙离子浓度升高,加强胰岛素颗粒胞吐作用,释放胰岛素。反之,当葡萄糖浓度降低时,通过ATP敏感性钾通道的耦联,抑制胰岛素释放。有功能的ATP敏感性钾通道由两种亚基(即inward rectifier、KIR6.X和磺脲类受体SURs),构成异四聚体。现证实,有一部分PHHI患者由于磺脲类受体基因或(和)KIR6.X基因的突变引起葡萄糖与胰岛素释放之间失耦联所致。从分子水平看,人体对激素的释放有分子水平更精细的调节方式。此外,激素受体水平的调节也是分子内分泌学研究的热点。前面述及的1,25-(OH)2D通过VDR受体对靶细胞作用的研究表明,其作用也受到许多因素的调节,例如VDR对配体的摄取能力、配体的代谢率,通过特异性配体诱导VDR受体的构型改变、VDR的数量、VDR翻译后修饰以及能否获得其他转录成分,这些因素的变化可以调节1,25-(OH)2D的作用。

分子生物学技术寻找和开发激素受体激动剂和拮抗剂

激素的激动剂(agonist)和拮抗剂(antagonist)常被用于激素作用的研究,但随着激素的作用机制的阐明,人们开始探索临床治疗疾病用的激素激动剂和拮抗剂。

胰高血糖素样多肽(glucagon-like polypeptide,GLP)是较早应用分子克隆技术发现的一种小肠激素。1993年,Bell等克隆得到编码GLP的前胰高血糖素原基因。GLP-1具有促胰岛素作用,2型糖尿病患者的胰岛β细胞能产生胰岛素。因此,大多数患者使用如磺脲类药物进行治疗,通过磺脲类药物与其受体结合,而促进胰岛素的释放来满足体内的需要,但由于磺脲类药物并不能促进胰岛素基因的转录,不能增加胰岛素的合成,因此许多2型糖尿病患者的β细胞最终因胰岛β细胞的储备耗竭而导致治疗失败,而且磺脲类药物可能会抑制心肌细胞的ATP依赖性钾通道,破坏了心脏在受损害时的内源性保护机制,因此增加心肌梗死等危险性(此点仍有争论)。虽然胰岛素增敏剂能促进外周组织的葡萄糖利用,减少肝糖原输出,或加强胰岛素对脂代谢、对细胞的作用等,而改善2型糖尿病。但有关GLP的深入研究已经显示,GLP-1可以诱导胰岛素的合成及分泌,而这些作用是葡萄糖依赖性的,GLP-1在治疗糖尿病方面较磺脲类药物更具优越性。此外,GLP-1降低胰高血糖素水平,减缓胃肠排空,抑制进食,提高胰岛素敏感性及刺激β细胞再生等方面,具有更为广阔的应用价值。

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