概述

卵细胞胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)技术的发展,使许多男性不育症患者获得了生育。但是ICSI的应用要求患者有成熟的活精子,使其在一些无精症患者中的应用受到限制。睾丸组织块和精原干细胞的移植技术的出现给这部份患者带来了希望。睾丸的生精功能有赖于精原干细胞的自我增殖,精原干细胞是精子发生的基础。这些细胞紧贴于曲细精管基膜,经过同源性扩增分化形成的精母细胞经过两次减数分裂形成精子细胞,最后形成成熟的精子。精原干细胞具有很强的自我更新和自我复制能力,有可能不断地产生精子,因此将供者的精原干细胞植入受者睾丸,利用生成的精子进行辅助生育技术,还可将供者的单倍型遗传给子代。与冷冻保存、体外培养等技术相结合,可广泛应用于男科学研究的诸多领域。

睾丸组织移植的研究现状

睾丸组织块异种移植发展迅速,目前已被广泛应用于不同种类动物及人睾丸组织的体外分化研究。睾丸组织移植包括睾丸碎片移植和冷冻-复苏睾丸碎片移植。Honaramooz等将新生小鼠、猪、山羊的新鲜睾丸组织移植到去势的免疫缺陷小鼠背部皮下,观察到至少有60%的移植物存活并最终产生成熟的、功能正常的精子,且其产生的精子经ICSI技术可产生下一代。表明新鲜睾丸组织移植可应用于不同的哺乳动物,另外移植组织还可使去势受体动物的激素恢复正常水平。Honaramooz等还将移植前的猪睾丸碎片冷冻保存后移植,发现睾丸组织即使冷冻2天或更长时间,移植后仍可完成精子发生和类固醇形成,从而为难以收集新鲜睾丸组织的移植提供了实验依据。供体动物种类、年龄、激素水平对移植物中生精细胞的发育有较大影响。受体移植部位环境变化对生精过程亦有影响。因此,对于成年人睾丸组织来说,激素水平并不是造成生精停滞的关键因素,其机制还有待进一步研究。

精原干细胞移植的基本概念和研究现状

精原干细胞是生殖细胞系中的双倍体细胞,胚胎原始生殖细胞由卵黄囊沿后肠的背系膜迁移到生殖腺嵴,在经历第一次分化后形成生殖母细胞,最后形成了未分化的精原干细胞,直接与基底膜相接触,在青春期开始时重新开始增殖成年期保持旺盛地增殖活力。精原干细胞潜在遗传了胚胎干细胞的多种特性,可作为体细胞谱系的前体细胞。目前其主要应用有:

  1. 精原干细胞移植和培养为探索精子发生和调控机制提供了重要策略;
  2. 精原干细胞转染技术为外源基因进入配子细胞提供了途径;
  3. 精原干细胞冷冻保存为肿瘤患者生育力的长期保存开创了新的思路;
  4. 精原干细胞可能为多能细胞发生的早期胚胎提供来源。

精原干细胞移植最早由Brinster于1994年报道。同其他器官移植相类似,精原干细胞移植首先需从供体组织中获得精原干细胞,应用显微外科技术将获得的精原干细胞移植入受体的睾丸组织,使供体细胞在受体内利用其细胞微环境,诱导精子发生,供体的精原干细胞分裂分化为精子。精原干细胞主要来源于供体的睾丸组织。已经采用的标本包括人、小鼠、大鼠、马、牛、猪、猴、仓鼠等哺乳动物类,在获得睾丸后将其剪碎,使用DNA酶、透明质酸酶、胶原酶、胰蛋白酶等消化处理后,提取精原干细胞。可以将供体细胞直接或者经冰冻保存,体外培养后,移植到受体睾丸组织。一般以小鼠为受体,将标记后的细胞采用显微操作技术,用玻璃显微穿刺针穿刺到受体睾丸中,用特殊的微量加样枪将标记细胞注入到受体睾丸组织。睾丸细胞混合物在移植前能被冷冻保存很长一段时间,并且冷冻解冻后,仍能进行正常的精子发生,从而为解决男性无精子症提供可能。

精原干细胞移植的方法

目前精原干细胞的移植多依赖于显微注射技术完成,包括曲细精管注射、睾丸网及输出小管注射、经超声引导穿刺注射。

  1. 曲细精管注射法Brinster等首次进行的精原干细胞移植是在解剖显微镜的协助下完成的。利用微量注射器连接细长玻璃管,在显微镜下,透过白膜寻找有曲细精管的位置,用注射针管刺入曲细精管内,施加一定的压力将细胞悬液注入生精小管内,悬液在管内的流动可以通过曲细精管内颜色的变化来观察。
  2. 睾丸网注射法及输出小管注射法Ogawa等提出了两种移植方法:①直接穿过睾丸被膜注入睾丸网;②通过成束的输出小管将睾丸细胞混合物注入到睾丸网。
  3. 经超声引导穿刺注射Joerg等用超声引导穿刺进行细胞悬液注射,对一些大型的受体动物,比如公牛进行移植。具体的操作与显微操作是类似的,不同的是采用超声显影来显示精曲小管的具体位置。

存在的问题

尽管精原干细胞移植在男性不育症的治疗上有潜在的应用价值,但要应用于临床尚需解决伦理、遗传、感染等方面的问题。如将人类精原干细胞移植入动物睾丸内,不但使人类生育力得以保存其精原干细胞数量尚可扩增,再将其移植回人类体内或进行卵胞质内单精子注射时,可能有使人类感染动物体内的病毒、或通过ICSI获得遗传性疾病的风险。即使将正常人的精原干细胞,移植入另一无精子症患者睾丸内,临床应用也有一定局限性且存在伦理问题。对青少年肿瘤患者,在全身放疗或化疗前保存精原干细胞,放疗或化疗后进行精原干细胞自体移植,尽管患者的生育力得以保存,但有致肿瘤再次复发的风险。另外精原干细胞移植后,在应用辅助生育技术时可能通过后生性机制改变胚胎细胞的生理,也存在后生性危险因素。因此,要完全解决上述问题来临床应用精原干细胞移植,也许还有很长的路要走。虽然,目前将此技术应用于临床尚有许多问题,相信随医学和社会科学的发展,这些问题终会得到解决。

(刘贵华 高勇 姜美花 张元原 项鹏 邓春华)

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