分子标记物检查

分子标记物

分子标记(molecular markers)的概念有广义和狭义之分。广义的分子标记是指可遗传并可检测的DNA序列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。

分子标记物特点

  1. 具有高的多态性;
  2. 共显性遗传(即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型);
  3. 能明确辨别等位基因;
  4. 遍布整个基因组;
  5. 除特殊位点的标记外,要求分子标记均匀分布于整个基因组;
  6. 选择中性(即无基因多效性);
  7. 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化);
  8. 开发成本和使用成本尽量低廉;
  9. 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。

分子标记的种类

一、基于分子杂交技术的分子标记技术

(1) 限制性片段长度多态性:1974年Grodzicker等创立了限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)技术,它是一种以DNA-DNA杂交为基础的第一代遗传标记。RFLP基本原理:利用特定的限制性内切酶识别并切割不同生物个体的基因组DNA,得到大小不等的DNA片段,所产生的DNA数目和各个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布情况。通过凝胶电泳分析这些片段,就形成不同带,然后与克隆DNA探针进行Southern杂交和放射显影,即获得反映个体特异性的RFLP图谱。它所代表的是基因组DNA在限制性内切酶消化后产生片段在长度上差异。由于不同个体的等位基因之间碱基的替换、重排、缺失等变化导致限制内切酶识别和酶切发生改变,从而造成基因型间限制性片段长度的差异。自RFLP问世以来,已经在基因定位及分型、遗传连锁图谱的构建、疾病的基因诊断等研究中仍得到了广泛应用。

(2) 数目可变串联重复多态性:数目可变串联重复序列(variable number of tandem repeats,VNTR)又称小卫星DNA(minisatellite DNA),是一种重复DNA小序列,为10到几百核苷酸,拷贝数10~10 001不等。VNTR基本原理与RFLP大致相同,只是对限制性内切酶和DNA探针有特殊要求:①限制性内切酶的酶切位点必须不在重复序列中,以保证小卫星或微卫星序列的完整性。②内切酶在基因组的其他部位有较多酶切位点,则可使卫星序列所在片段含有较少无关序列,通过电泳可充分显示不同长度重复序列片段的多态性。③分子杂交所用DNA探针核苷酸序列必须是小卫星序列或微卫星序列,通过分子杂交和放射自显影后,就可一次性检测到众多小卫星或微卫星位点,得到个体特异性的DNA指纹图谱。

二、基于PCR技术的分子标记技术

(1) 随机引物的PCR标记:所用引物的核苷酸序列是随机的,其扩增的DNA区域事先未知。随机引物PCR扩增的DNA区段产生多态性的分子基础是模板DNA扩增区段上引物结合位点的碱基序列的突变,不同来源的基因组在该区段上表现为扩增产物有无差异或扩增片段大小的差异。随机引物PCR标记表现为显性或共显性。

(2) 特异引物的PCR标记:特异引物的PCR标记所用引物是针对已知序列的DNA区段而设计的,具有特定核苷酸序列(通常为18~24bp),可在常规PCR复性温度下进行扩增,对基因组DNA的特定区域进行多态性分析。

三、基于限制性酶切和PCR技术的DNA标记

(1) 扩增片段长度多态性:扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)是RFLP与PCR相结合的产物,其基本原理是先利用限制性内切酶水解基因组DNA产生不同大小的DNA片段,再使双链人工接头的酶切片段相边接,作为扩增反应的模板DNA,然后以人工接头的互补链为引物进行预扩增,最后在接头互补链的基础上添加1~3个选择性核苷酸作引物对模板DNA基因再进行选择性扩增,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离检测获得的DNA扩增片段,根据扩增片段长度的不同检测出多态性。

(2) 酶切扩增多态性序列(cleaved amplified polymorphism sequences,CAPS):技术又称为PCRRFLP,它实质上是PCR技术与RFLP技术结合的一种方法。CAPS的基本原理是利用已知位点的DNA序列资源设计出一套特异性的PCR引物(19~27bp),然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段,接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物,凝胶电泳分离酶切片段,染色并进行RFLP分析。

四、基于DNA芯片技术的分子标记技术

核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记是美国学者Lander E于1996年提出的第三代DNA遗传标记。SNP是指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异或只有小的插入、缺失等。从分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测,SNP标记可帮助区分两个个体遗传物质的差异。人类基因组大约每1000bp SNP出现1次,已有2000多个标记定位于人类染色体,对人类基因组学研究具有重要意义。

分子标记的应用

survivin在男性生殖中的表达

survivin是一种细胞凋亡抑制蛋白,它在细胞分裂时调控细胞凋亡,表达于人类的正常睾丸组织中。研究显示,survivin是精子发生过程中的一个潜在的分子标志物,它的表达在生精障碍的患者中有明显改变。

不断有研究表明,survivin在人类胚胎发育中曾大量转录,而且survivin的同族体TIAP与鼠类的胸腺和睾丸等多种组织的增殖有关。survivin调控细胞增殖、细胞周期和细胞程序性死亡的这些作用,使其成为调节生殖细胞产生的另一个候选基因。Weikert等用RT-PCR方法检测了30例男性不育症患者的睾丸组织中survivin表达,发现在睾丸活检显示精子发生正常的标本中均有survivin mRNA的特征性表达。在减数分裂前精子成熟停止的标本中却没有检测到;而在减数分裂后精子成熟停止的患者睾丸组织中也发现有survivin mRNA。他们在随后的进一步实验中,发现在生精异常患者的睾丸组织中,survivin的表达明显减少,而且表达水平与生精障碍的程度一致。

用于疾病诊断和遗传病连锁分析

1980年,Bostein等成功地将PFLP技术用于镰刀型贫血症的诊断分析,开创了基因诊断的先河。PFLP是以孟德尔方式遗传,因此可以作为染色体上致病基因座位的遗传标志。目前,许多与相连锁的致病基因得以定位。小卫星和微卫星因其高度多态性而被广泛用于疾病诊断和遗传病的连锁分析。随着低成本、通量SNP检测技术方法的出现,作为数量最多且易于批量检测的多态标记,SNP在连锁分析与基因定位,包括复杂疾病的基因定位、关联分析、个体和群体对环境致病因子与药物的易感性研究中将发挥愈来愈重要的作用。

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