FIA荧光免疫技术原理

荧光免疫分析(fluorescence immunoassay,FIA)具有免疫反应的高特异性和荧光技术的高敏感性等优点,其方法很多,如荧光偏振免疫分析和现有免疫方法中灵敏度较高的时间分辨荧光免疫分析(TRF)等。通过荧光显微镜、显微荧光分光光度计、流式细胞仪和时间分辨荧光仪等仪器进行定性或定量测量,在内分泌代谢疾病的真的中叶有了广泛应用。

FIA的原理与RIA相同,只是标记物由核素改成了荧光素。荧光素是一种在激光的照射下能发生强烈荧光的物质,其吸收光能后,在极短时间(10-8~10-9秒)内,产生激发态分子,释放出波长比激发光更长的可见光,将具有这种特性的物质用化学方法结合在抗体(或抗原)分子上,后者与相匹配的抗原(或抗体)结合后,通过荧光检测仪观察荧光或测量荧光强度,判断抗原(或抗体)的有无和分布情况,或检测样本中抗原(或抗体)的含量。

荧光免疫技术分为直接法/间接法/补体法/双标记法四种

  1. 直接法:将特异性荧光抗体直接加在固定的待检标本上(含抗原),使之形成抗原-抗体复合物,以鉴定未知抗原。并可根据荧光的分布和形态,确定其抗原性。本法的优点是简便、快速、特异性强;缺点是不能用已知抗原检测未知抗体,而且检测每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体,其敏感性较差。常用于细菌、病毒的快速检查。
  2. 间接法:又称双抗体法。利用荧光标记抗体鉴定未知抗原或未知抗体,荧光标记的抗球蛋白抗体可检测各种未知抗原或抗体,其敏感性比直接法高5~10倍,缺点是参加反应的组分较多,步骤繁杂,所需对照多。常用于各种自身抗体的检测。
  3. 补体法:利用荧光素标记抗补体抗体,以鉴定未知抗原或抗体。本法仅需一种标记抗补体抗体,由于补体与抗原-抗体复合物结合无种属特异性,从而不受已知抗体或待测血清的动物种类限制,故可检测各种抗原-抗体系统。缺点是容易产生非特异性干扰,需要较多的对照,补体由于不稳定,不易长期保存。
  4. 双标记法:用异硫氰酸荧光黄(FITC)和四乙基罗丹明(RB200)两种荧光素标记不同抗体,对同一基质样本进行检测,若有相应的两种抗原存在,则显示不同颜色的荧光。

荧光素标记抗体

用于标记抗体的理想荧光素应有以下特点:

  1. 具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团,结合后不易解离,而未结合的荧光素及其降解产物容易清除;
  2. 与抗体结合后能保持抗体固有的生化特性、免疫活性及特异性;
  3. 荧光效率(发射荧光的光量子数/吸收光的光量子数)高,与蛋白质结合后无明显下降;
  4. 荧光色泽与观察背景的色泽比衬明显,易于判断;
  5. 结合的方法简便、迅速、安全无毒;
  6. 试剂易得。

1. 异硫氰酸荧光黄(fluorescein isothiacyanate,FITC)

分子量为390Da,性质稳定,在低温干燥条件下可保存多年,室温下亦可保存2年,易溶于水和酒精,有同分异构体Ⅰ、Ⅱ及一些前体。异构体Ⅰ的荧光强度高,与蛋白质的结合更稳定。

FITC分子中带有异硫氰酸活性基团(—N‖C‖S)。在碱性条件下,与蛋白质分子中赖氨酸的侧链氨基(—NH2)反应,经碳酰胺化以共价键形式牢固结合。一个分子的IgG有86个赖氨酸残基,一般最多能标记15~20个荧光素分子,FITC的最大吸收峰波长为490nm,标记抗体后则为495nm,激发后最大发射光波长为523nm,呈明亮的黄绿色荧光。

2. 四乙基罗丹明(rhodamine B200,RB200

分子量为580Da,不溶于水,易溶于酒精和丙酮。性质稳定,可长期保存。RB200不能直接和蛋白质结合,须先在五氯化磷(PCl5)作用下转变为磺酰氯化物RB200;在碱性条件下,与蛋白质的赖氨酸氨基结合。RB200的最大吸收峰波长为575nm,激发产生最大发射光波长为595~600nm,呈明亮的橙色荧光。由于荧光效率低,一般不单独使用,多用于与FITC的双标记衬比染色。

3. 四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothiocyanate,TRITC)

本品是RB200的衍生物,分子量443Da。通过异硫氰酸活性基团与蛋白质结合,其最大吸收峰波长为554nm,激发后最大发射光波长为620nm,呈橙红色荧光。

4. 其他荧光素

除上述三种荧光素之外,还有多种荧光素可选择,如7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(7-amino-4-methylcoumarin-3-acetic acid,AMCA)、罗丹明6G、四甲基罗丹明、Texas红等。

近年制备了一类Alexa荧光物质,如Alexa-350、-430、-488、-532、-546、-568、-594(数字代表物质的最大激发荧光波长,单位为nm)等。这是一类具有高稳定性和高荧光强度的新型荧光物质,其特点是在pH 4~10范围内稳定。例如,Alexa-546较四甲基罗丹明的荧光强2倍以上,Alexa-568或Alexa-594也比通常的RB200要强数倍以上。此外,Alexa染料的酰肼衍生物的荧光鲜亮,是一种良好的甲醛固定标本的荧光探针标记物。

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