光谱(optical spectrum)是一种电磁波,其波长用nm (1nm=10-9 m)表示。波长为400~760nm的光谱称为可见光谱(如太阳光和白炽灯光等),即可见的由红、橙、黄、绿、蓝、青、紫等颜色组成的复合光;波长为200~400nm的光谱称紫外光谱;波长短于200nm的光谱依次分别称为远紫外光谱、X射线和γ射线;波长长于760nm的光谱依次称为红外光谱、远红外光谱、微波和无线电波。用棱镜或光栅等分光器将复合光分成单色光的现象叫分光(光谱学,spectroscopy)。

如果让一束可见复合光穿透一装有有色溶液的玻璃杯再经棱镜分光后,其中某些单色光带变暗,即某些单色光被有色溶液选择性吸收,这种现象称吸收光谱(absorptive band)。吸收光谱的产生是由于溶液中物质的分子或原子受入射光照射时,其电子从基态跃迁至较高能级并吸收入射光的辐射能所致。吸收光谱也可发生于其他非可见光(紫外光或红外光等)。不同物质的分子和原子具有吸收不同光谱的特性,因此,可以利用物质的光谱特性和强度测定其含量。

紫外光谱法是基于物质分子和原子吸收或发射光谱而建立的分析技术

紫外-可见光谱法属于吸收光谱法范畴,其理论基础是Lambert-Beer的光吸收定律,即某一波长的光穿过一匀质透明溶液时(下图),其中一部分被吸收,另一部分被散射和反射,透过光的强度(I)与溶液的液层厚度(b)、溶液的浓度(C)和入射光的强度(I0)有关。当I0一定时,b和C越大,则I越小;反之,当b和C一定时,I0越强则I也越强。这里I0和b可以是恒定的常数,则C与I在一定条件下成简单的反比关系,即溶液的浓度(C)越大,透过光的强度(I)越小;换言之,溶液的浓度越大,吸收光的强度越大,透过光的强度就越小。溶液吸收光的强度常用吸光度(A)表示,当条件一定时,A与上述各因素之间的关系可用A=log I0/I=abC表示(式中a为吸光系数,是与入射光波长和溶液性质有关的常数),这就是Lambert-Beer的光吸收定律,即溶液对入射光的吸收程度(A)与溶液的液层厚度和溶液的浓度的乘积成正比。当a和b为常数项时,在一定条件下,A仅与C成正比,通过测定溶液的A与参考品比较可求得待测物质的浓度。

溶液吸收光示意图

溶液吸收光示意图

溶液中物质的吸光系数(a)是吸收光谱的一个重要参数,它与物质的测定灵敏度密切相关,不同的物质具有不同的a。a是指溶液的液层厚度为1cm和物质的浓度为1mol/L时的吸光度,又称摩尔吸光系数(ε)。物质的ε越大,表示其对某波长(最大吸收波长)的光的吸收能力越强,即被检测的灵敏度就越高。如铁离子与硫氰酸盐的结合物ε为7000,而与亚铁嗪的结合物ε为27 900,后者约是前者的4倍,即后者的测定灵敏度比前者高3倍。了解待测物质分子的吸光系数对提高分析灵敏度至关重要。未知分子量的物质也可用百分浓度代替摩尔浓度,求出其百分吸光系数,同样可反映物质对光的吸收特性。

利用光吸收定律而设计的光谱分析法又称光度法。光度法有比色法和分光光度法两种,其基本原理相同,不同的是比色法采用滤光片获取单色光,而分光光度法是采用棱镜或光栅等分光器获得单色光,但分光器所得单色光的纯度远高于滤光片。比色法又分目视比色法和光电比色法,但因其分析误差较大,已逐渐被淘汰。

分光光度法测量溶液中的有色化合物

分光光度法分可见光分光光度法和紫外光分光光度法,前者是指利用可见光波长范围内(400~760nm)的某一波长的光作光源的分析方法,多用于测量溶液中的有色化合物,如尿中的雌二醇、雌三醇、孕二醇、皮质醇、肾上腺素和去甲肾上腺素的代谢产物香草基扁桃酸(VMA)、17-酮类固醇、17-羟皮质类固醇等的化学比色测定法就属于可见光分光光度法;后者是指用紫外光波长区域内(200~400nm)某一波长的光作光源的分析方法,可对具有π-π或P-π共轭结构的化合物进行直接检测,待测物质不需显色,样品不被破坏,该法常用于检测核酸、芳香氨基酸及芳杂环类化合物,如在350nm波长下,测定尿液间甲肾上腺素(TMN)等。

该技术还被广泛用做HPLC、高效毛细管电泳和流动注射分析的检测器,其样品用量少(数微升,μl),检测灵敏度高(10-7~10-12g)。依测定目的不同,分光光度法在测定单组分物质时,还可分为吸收系数法与差示分光光度法;测定多组分混合物时,有解联立方程法、双波长法、等吸收点法和导数光谱法等。随着技术的进步,当紫外光分光光度法用二极管阵列取代光电倍增管时,收集的信号经计算机处理,可得到待测组分吸收峰的三维图像。

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