高效液相色谱法(HPLC)检测器及其应用

检测器是高压液相(high pressure liquid chromatography,HPLC)的分析系统,对待测组分起定性和定量分析作用。根据检测目的及样品组分的物理化学特性不同,检测器有紫外-可见光检测器(包括固定波长、可变波长、二极管阵列和低惯性快速扫描检测器等)、荧光和荧光增强检测器、电化学检测器(包括电导、电势、安培、质谱和拉曼光谱检测器等)、化学发光检测器、折光率检测器、红外光检测器、介电常数检测器、放射性检测器、电子捕获检测器及原子吸收检测器等类型。其中在激素测定中较常用的有紫外-可见光检测器(ultraviolet-visible detector,UVD)、荧光检测器(fluorescence detector,FD)、电化学检测器(electrochemical detector,ECD)和质谱检测器(mass spectrometry detector,MSD)等。

超高压液相(ultra high pressure liquid chromatography,UHPLC)系统使用更高的层析压力和更细的填充柱,明显降低了增效的时间,加快了分析时间,敏感性、峰值和重复性显著提高。

紫外-可见光检测吸收可见光的组分

紫外-可见光检测器 (UVD)是HPLC最常用的检测器,其检测灵敏度(可达10-7~10-12 g)、精密度和线性范围均较好,对紫外和可见光有吸收的组分均能检测。它的检测原理是经色谱柱分离的组分通过检测器流通池(下图)时,可吸收特定波长的紫外线或可见光,组分的吸光度与浓度之间的关系服从Lambert-Beer定律。

检测器流通池结构示意图

检测器流通池结构示意图(A):紫外-可见光检测器流通池;(B):荧光检测器流通池

UVD由光源、流通池、检测原件(光电倍增管或二极管阵列装置)及记录器等组成。检测原件为二极管阵列装置的UVD称为二极管阵列检测器(diode array detector,DAD)或硅靶摄像管,DAD是设计最新颖的检测器之一,可同时反映组分的吸光度随时间与吸收波长的变化,并同时获得组分的定性和定量信息。DAD的基本原理是来自光源的紫外/可见光,经流通池被组分吸收后进入分光单元,然后按波长(190~800nm)顺序聚焦在阵列式接收器上。其光学系统设计可使阵列的每个二极管(共有500~600个)同时收到不同波长的光,光信号被迅速转换成电信号,通过这种方式最短能在几毫秒(ms)时间内获得组分经过流通池的吸收光谱,这些动态光谱吸收图经计算机处理后,可转换成反映组分出峰时间、吸光度与吸收波长的三维图。下图是用HP1100型HPLC联合DAD检测雌激素(尼尔雌醇)和孕激素(左旋炔诺孕酮)的三维色谱图。

二极管阵列检测器三维色谱图扫描图

二极管阵列检测器三维色谱图扫描图

荧光检测器显著提高检测灵敏度

荧光检测器(FD)的检测原理同荧光光谱法,它与荧光分光光度计在结构上的重要区别是用流通池取代盛液池,检测过程在连续流动状态下进行,且检测的几乎是经色谱柱分离在流动相中的纯组分,因而大大提高了FD的检测灵敏度(可达10-15mol/L),特别是用激光作激发光源时,灵敏度更高。

FD主要由激发光源、流通池、光电倍增管和记录仪等组成。激发光源采用紫外光或激光,最常用的激光光源的波长为325nm,强度为5~10mW的氦镉(He-Cd)或CO2光源。FD只适用于检测能产生荧光或其衍生物能发射荧光的物质,如氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合物及酶等。

电化学检测有机物

电化学检测器(ECD)有安培检测器、电导检测器、电势检测器和质谱检测器等多种类型,其中安培检测器(ampere detector,AD)是应用较广的一种,常用于检测能产生氧化或还原反应的有机物,其结构见下图,它类似于一个微型电解池。检测原理是根据两指示电极(工作电极和参考电极)间在恒定的小电流通过时的电导或电势等的变化来测定被电解组分的浓度变化。AD的检测灵敏度在很大程度上取决于被测定组分的氧化或还原能力,它对有机还原性物质的最低检测限可达10-12g。AD常用于检测体液中的肾上腺素及其衍生物、多巴胺和组胺等。

电化学检测器结构示意图

电化学检测器结构示意图

HPLC检测激素和药物

HPLC通常是利用已知的标准品,与样品中待测组分的保留时间或相对保留时间相互对照进行定性分析,与色谱图的峰面积或峰高相互比较进行定量分析。HPLC在临床实验室诊断中,已被用于测定各种激素及药物浓度监测等,可测定的物质有血中的儿茶酚胺和去甲肾上腺素、黄体酮和睾酮、血尿中的皮质醇、T4结合球蛋白、植物雌激素的代谢产物、雌酮和雌二醇、血和头发中的皮质类固醇激素、胆汁中的褪黑激素、水溶性维生素、脱氢表雄酮(DHEA)、尿中的雄激素、尿中骨Ⅰ型胶原的降解产物吡啶啉(Pyr)和脱氧吡啶啉(D-Pyr)等,与质谱法或气相色谱联用测定尿中5种含硫酸盐的雌激素(E1-3S、E3-3S、E2-3S、E2-17S和E2-3,17S)、血清皮质脂酮、人工合成降钙素的降解产物、血浆中的脱氢异雄酮、血中的视黄酸浓度,监测雌激素替代治疗后的排泄产物、血清25(OH)、PTH及其片段、血清中非结合类固醇、尿中睾丸激素、各种氨基酸、血浆胰高血糖素样肽以及分离分析血清中的瘦素及生长激素结合蛋白等。

此外,随着中药现代化研究的不断深入,HPLC、高效毛细管电泳、色谱-质谱联用技术等现代分离分析技术已在中药研究中得到广泛的应用。