各种糖化血红蛋白测定方法的特征总结

目前测定GHb的方法有多种,这些方法从表面上看都是测定GHb的同一生理过程,但实际上不同种类的方法是根据不同的原理而进行的。因此,由于方法的不同所测出的数值及代表单位是不同的。例如层析法中有些方法所测定的是HbA1 (a+b+c+),而有些方法则是只测HbA1c,它们是属于半定量性的,故表示单位为“%”。但在比色法中凡是在一定条件下生成5-羟甲基糠醛的化合物者都在被测定之列,它接近于定量性质,表示单位为nmol HMF/mg pr。因此,在评价方法或比较不同实验室的测定结果时必须加以注意。由于方法有多种,本文对所列全部方法仅作一般介绍,而对临床常用的方法作重点介绍。

基于电位变化的物理方法

阳离子交换树脂微柱层析法

原理:根据HbA1可带电性之不同进行分离,微柱内载体(充填物)的阳离子交换树脂(Bio-Rex 70)在pH近7时解离后带阴电荷,而Hb解离后带阳电荷,两者形成离子键,因HbA1的阳电荷比HbA少,与树脂结合力相对低,故易被洗脱下来,再分别测定洗脱液中的HbA1(或HbA1c)和总Hb的吸光度(OD)可计算出HbA1 或HbA1c占总Hb中的百分值。

主要操作步骤

  1. 血标本采取,使用抗凝剂采取抗凝血,标本可在4~8℃保存一周。为了排除不稳定物质的干扰,多需将血标本反复用生理盐水洗涤离心或置于37℃水浴孵化数小时的“预处理”,该过程甚为烦琐。有的厂家特制“预处理”装置,但价格昂贵。
  2. 溶血物制备,用溶血液溶血。
  3. 将一定量溶血物加于微柱内树脂上。
  4. 用硼酸盐-磷酸pH 6. 7的缓冲液洗脱掉HbA1a和HbA1b,如单测HbA1则不需本步骤。
  5. 用磷酸盐pH 6. 8的缓冲液洗脱HbA1或HbA1c。
  6. 用一定比例的溶血物加蒸馏水制备Hb的稀释液。
  7. 在分光光度计415nm分别测定⑤的OD值再计算出其百分值。

测定内容:HbA1或HbA1c。优点:价廉、操作快速(预处理除外)。缺点:易受以下多种因素的干扰:

一、不稳定型HbA1:如上所述在HbA1的生成过程,首先产生不稳定型HbA1c,据报道在糖尿病患者的HbA1c中约有15%~30%的醛亚胺,而且随着血糖的增高而递增。表现在糖尿病酮症酸中毒及不稳定型糖尿病,当血糖剧增时HbA1亦剧增,血糖稍下降,HbA1却骤减,表明有不稳定型HbA1的存在。本法如果不消除不稳定物质的预处理步骤,可造成假性增高的测定结果。

二、HbF:在胎儿时期红细胞中主要含HbF(占Hb中的70%~80%),生后不久便逐渐降至成人的正常浓度,仅占<1%并保持恒定,因含量极微,一般并不干扰HbA1的测定。但约有30%的成年正常人群和糖尿病人群中呈HbF异常增高症,可影响本法,使HbA1c呈假性增高。

三、温度:大量资料表明凡是阳离子交换树脂装柱的层析法均受温度的影响,本法对测试实验室环境的温度十分敏感,要求必须严格控制在22~25℃,其结果才能准确。有作者指出温度每差± 3℃,其所测HbA1值可假性增高或降低1%值。

四、其他因素:尿毒症患者(血中氨甲酰Hb增多)、酒精中毒者(乙醛加合物增多),某些异常Hb症等均可使阳离子交换树脂法呈HbA1或HbA1c值假性增高。相反使红细胞寿命缩短的一些疾病如慢性严重贫血、大出血、溶血性贫血及其他如妊娠早期等不但使本法所测值假性降低,对所有方法均有所影响。概之如下表。

除糖尿病外影响GHb假性增高或降低的因素

除糖尿病外影响GHb假性增高或降低的因素

综上表明,阳离子交换树脂法测定GHb不是一种精确、可靠、重复性强、灵敏度高的检测方法,用作要求不太严格的衡量糖尿病长期控制水平的监测指标,尚可勉强采用,而作为要求精确程度高的科研手段是困难的。

高压液相法(HPLC)

Allen于1958年最早应用柱层析法研究Hb,当时所用柱直径为2. 5cm,长度为35cm,由于柱过长后来称为长柱法,载体为Amberlite IRC 50,用量很大,做一次实验需要56小时。由于耗时太长,故1917年Trivelli用Bio-Rex 70阳离子交换树脂代替Allen所用的树脂,缩小了柱的大小为2cm×17. 5cm,缩短实验时间为12小时,仍耗时太长,仅能用作基础研究,不能用于做常规检测。

在Trivelli长柱法的基础上,1978年Cole及Daris等先后研制出高压液相色谱法,最初的产品一个实验在27分钟内即可完成,后来缩短为4分钟。所谓高压液相色谱法就是采用微粒的阳离子交换树脂作载体,按长柱法进行装柱,流动相给予高压。因此,它具备长柱法划分能力强的优点,同时具有微柱法省时的特点。近年国外又推出高压液相测定GHb全自动分析仪,如日本京都第一科学的产品,该仪器是由阳离子交换树脂装柱、高压液相、22℃恒温设备、去除不安定物质装置及电脑控制联合所组成,可在4分钟内同时记录出HbA1、HbA1a+b、HbF等结果,是目前各种GHb测定方法中高效、精确的方法之一,此种虽属理想的方法,但仪器价格十分昂贵,仅在一些发达国家使用。此外,它也受上述“其他因素”的干扰。采用本法研究证明HbA1或HbAlc基本上不受性别及增龄的影响。

  1. 测定内容:HbA1、HbA1a、HbA1b、HbA1c 及HbF。
  2. 优点:一般血标本在高压液相图谱上可出现4个峰(下图)。精密度及灵敏度高、准确性强,其批内变异在2%,批间变异在4%以下,是目前最标准化的糖化血红蛋白测定方法。
  3. 缺点:价格昂贵。此外它也受上述“其他因素”的干扰。

正常参考值:HbA1c 3. 84~5. 34,HbA1 5. 33~7. 11

琼脂凝胶电泳法

  1. 测定内容:HbA1。
  2. 优点:价廉、操作快速,可使用标准化的琼脂平皿,受温度影响较小。
  3. 缺点:除温度外同样受上述多种因素的影响,且准确性较差,目前已很少应用。

等电点聚集法

也是测定GHb的新技术,它是在聚丙烯酰凝胶中加入载体两性介质(如ampholin)的薄板上形成一个由阳极到阴极逐渐增加的pH梯度,溶血液中各个组分将移动到各自的等电点的pH位置上,这样就得到比一般电泳法更好的分划效果和比较集中的色带,通过分辨率高的微量光密度仪扫描,可以准确地测定出各自组分的含量。由于它能够分辨出一级结构不同的HbA、HbA1、HbA1c、HbFⅠ、HbFⅡ、Hbs、及Hbc等,可完全避开各种物质的干扰,是一种理想的方法,但仪器价格相当昂贵,难于用作常规检测。

Glycated Hemoglobin专用测定Hi-Auto A1cTM测定结果记录例(正常人)

Glycated Hemoglobin专用测定Hi-Auto A1cTM测定结果记录例(正常人)

基于化学原理的方法

TBA(thiobarbituric acid)比色法

  1. 测定内容:HbA1。
  2. 优点:除上述受不稳定HbA1c影响外,不受其他多种干扰因素的影响,价廉。
  3. 缺点:操作烦琐,特别是操作中需要较长时间的100℃水浴煮沸水解过程,费时费力不易掌握,此外也受不稳定物质的影响。

亲和色谱微柱法

亲和色谱(affinity chromatography)技术是色谱分析的新进展。1981年Mallia首先将此项技术应用于GHb的测定,很快受到学者们的重视,作为糖尿病理想的检测手段已获公认。国外近年已有试剂盒出售,但价格昂贵。1989年国内有关单位已将此项先进技术引进并自制成具有同类国际水平的试剂盒,适宜我国国情,可广泛推广使用。

原理:GHb的亲和色谱载体是氨基苯硼酸琼脂糖凝胶,当总的GHb通过载体时,稳定型GHb分子表面含葡萄糖的顺式二糖醇(cis-diol)部分与载体固定相上的硼酸基因呈配位特异结合,其他非糖化Hb及不稳定型GHb、HbF等,随流动相(天门冬酰胺缓冲液)流出,然后用另一种含糖或多羟化合物流动相(山梨糖醇缓冲液)将GHb洗脱下来,利用两部分Hb本身的颜色,在415nm条件下测定并计算出亲和色谱所测的GHb占总Hb的百分值。其结合反应式见下图。

亲和色谱微柱与HbA1c的结构式(引自松宫和人,1986)

亲和色谱微柱与HbA1c的结构式(引自松宫和人,1986)

主要操作步骤:①血标本采取同树脂法,但其血标本可在1~8℃冰箱中保存3周。②将溶血液加至载体上,然后用天门冬酰胺洗脱液先洗出非糖化的HbA0、HbF及其他不稳定物质。③用山梨糖醇洗脱液洗出GHb。④测试②、③的OD值再计算出GHb。

测定内容:Abraham等研究指出,亲和色谱所测GHb不仅包括HbA1部分,还包括HbA0中糖化组分,同时指出亲和色谱GHb并非全部Hb的糖化组分,只测出HbA1(a1+a2)+HbA1b中的10%、HbA1c中的52%及HbA0中糖化组分的38%,因此将亲和色谱所测出的GHb称为总的GHb是不确切的,事实上不是总的GHb,而是占不同百分数的各种GHb。目前对其测定内容的命名国内外尚不统一,有的称为总的GHb,当然是不准确的,日本生化学工业株式会社所生产试剂盒称为糖化-亲和GHb(Glyc-Affin GHb)。我们建议在未统一名称之前暂称为“亲和色谱GHb”为宜,以便与其他方法所测HbA1或HbA1c相区别。

优点:操作简单、快速、价廉,不受上述各种干扰因素的影响。对血标本储存的时间也不像离子交换法那样严格。据报道,EDTA抗凝血标本在20~24℃室温下可保存3周,其GHb值仍与第一天同一血标本值无差异。但本文作者观察,以保存在4~8℃冰箱中更为可靠。

缺点:不能测试GHb的单一组分,且包含HbA1的糖化组分,但并不影响它作为可靠的糖代谢指标的价值。大量实验还证明,该法所测GHb值与HPLC等法所测HbA1、HbA1c及空腹、餐后2小时血糖均呈高度相关,表明该法对糖尿病患者是一种较理想的病情监测指标。

1989年北京医院邱文升医师赴日本研修期间,对本方法进行实验研究,并且发表文章。证实亲和色谱微柱法测定糖化血红蛋白是比较适合于中国国情的,故将此项先进技术率先引入中国,从而填补了我国当时尚缺乏有关糖尿病长期检测项目之空白,作为糖尿病检测新方法之开展与推广起到抛砖引玉、推波助澜的作用。

实践证明亲和色谱微柱法的确经久不衰,至今仍被国内外广泛使用中。

免疫凝集抑制法(DCA 2000 HbA1c测定仪)

原理:为缬氨酸β-N-末端糖化的血红蛋白提供了一个容易被抗体识别的抗原表位。可以用单克隆抗体或多克隆抗体进行放射免疫分析和免疫酶学分析测定,抗体特异识别β链N-末端糖化的血红蛋白最后4~8个氨基酸组成的抗原表位。

HbA1c的检测是基于乳胶颗粒凝集的抑制作用,这些外涂单克隆抗体的乳胶颗粒与HbA1c结合在一起,涂有单克隆抗体的乳胶颗粒与一种特有的凝集物发生反应。这种凝集物是一种含有大量HbA1c半抗原的合成聚合物。乳胶颗粒的凝集结果由光吸收测定出来,多余的游离HbA1c就会抑制这种凝集作用并且导致与全部HbA1c成比例的低吸收读数(下图)。

抗体-乳胶结合位点的竞争、抑制凝集反应

抗体-乳胶结合位点的竞争、抑制凝集反应

DCA 2000无需取静脉血,只需1μl指血,快速、准确,可打印结果。

从上述多方面衡量,适宜我国国情,并在各级医院都能常规应用的,我们认为首选的应是亲和色谱法,其次是交换树脂法(DCA 2000 HbA1c测定仪)。

各种测定方法的特征及正常参考值

目前所有糖化血红蛋白分析方法的特点

目前所有糖化血红蛋白分析方法的特点
目前所有糖化血红蛋白分析方法的特点

糖化血红蛋白参考范围

糖化血红蛋白参考范围

数值来自包装说明书或参考文献,*有不同的标准品;**“标准血红蛋白”;GHb:总糖化血红蛋白

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