体内非酶糖化反应本身及其产物在糖尿病并发症发生中的作用

体内外实验表明,非酶糖化反应本身及其产物可能通过以下几个方面造成损伤。

糖化-氧化损伤

既往认为,非酶糖化反应产物——AGEs是其可能造成机体损伤致病的原因。非酶糖化反应仅发生在蛋白质氨基与糖之间,而且半衰期较长的蛋白质易被糖化。最近的研究表明,这种非酶糖化反应不仅可发生在半衰期较长的蛋白质,而且半衰期较短的蛋白质,如载脂蛋白(apoprotein)和低密度脂蛋白(LDL)也可和糖反应生成AGEs。糖化反应时还伴有氧化反应,可生成超氧化物。氧化反应及产物是公认的造成机体组织损伤的机制之一。脂质糖化终末产物生成速率与糖、脂浓度有关。糖尿病患者ApoB-AGEs水平较正常人高出2倍,lipid-AGEs水平高出4倍。糖尿病患者有很高的白内障发生率。晶状体蛋白质是一个更换期很长的蛋白质,在长期高血糖的影响下,晶状体蛋白质的糖化氧化反应缓慢进行着,AGEs的堆集交联化使晶状体逐渐的混浊棕化,厚度及硬度不断增加,导致白内障的形成和发展。晶状体蛋白质糖化与白内障的生成过程可以在体外进行复制,如果把牛的晶状体放在葡萄糖的溶液中,使溶液的pH值符合体内生理条件,在37℃保温,10个月后可以看到与葡萄糖共同保温的晶状体蛋白的颜色及光学性质与糖尿病白内障晶状体几乎完全一致。这也间接地证实了白内障与糖化氧化反应的密切关系。值得注意的是,非糖尿病的老年性白内障,也有类似的晶状体蛋白质的糖化过程,例如人的晶状体中也有AGEs存在,而且随着年龄的增加逐渐增多,晶状体蛋白质上存留的赖氨酸逐渐减少。晶状体蛋白质上的赖氨酸是进行糖化反应的底物,在白内障发展的过程中减少得更为明显。随着年龄的增加,晶状体中的葡萄糖及6-磷酸葡萄糖的含量也在不断增加。在晶状体中的AGEs的堆集,可出现在外囊、皮层及内核,尤以外囊更为明显。这些情况都说明不论是糖尿病性或老年性白内障的生成过程中都有晶状体蛋白质糖化的因素存在。

关于红细胞的糖化已有较多的研究报道。糖化血红蛋白的测定已作为糖尿病控制指标广泛应用。血红蛋白-AGE的生成可使血红蛋白的氧结合率明显降低(大约可降低50%),潜在性的影响氧的交换。除了血红蛋白外,红细胞膜蛋白也能被糖化,生成AGE结合物,其结果可以造成红细胞的变形性及膜流动性均减小,氧释放量及酶活性的降低。Fleeha等报道,糖尿病患者的红细胞膜蛋白糖化后,可使膜中的Ca2+-ATP酶活性降低,导致细胞内钙量的积蓄及膜的硬化,由于细胞内渗透压增大,使细胞发生肿胀,体积增大,当然这些对微循环都可以产生潜在影响。笔者也曾报道过169例糖尿病患者,他们的红细胞膜蛋白糖化与一些临床指标,如尿素氮、肾脏病变、听力变化等的关系,表明在糖化红细胞膜蛋白超常的情况下,临床上患者的肾脏、视网膜、周围神经的病变及老年患者听力减退的发生率都明显增加,特别是通过随访观察还发现,当患者的糖化红细胞膜蛋白由正常转为超常的增高时,蛋白尿、周围神经病变和听力减退的发生率有明显增加。进一步说明当糖尿病患者血糖控制不良而造成红细胞的血红蛋白及膜蛋白的糖化显著增高时,肾脏、视网膜及周围神经都能出现不同程度损伤。

以低密度脂蛋白(LDL)及极低密度脂蛋白(VLDL)升高为特征的高脂血症及血管硬化,不仅见于大多数糖尿病患者,而且他们因血管硬化而导致的心肌梗死及脑卒中的发生率也显著增高。严重的糖尿病患者血浆LDL及载脂蛋白B(Apo-B)中的AGE水平都成倍地高于正常人群,而且这些脂蛋白中脂质部分的AGE也有同样程度地增高。LDL,Apo-B中AGE的生成无疑对血管硬化产生影响。但很难区分糖尿病患者的血管硬化是由于糖化还是氧化机制所促成的。除了LDL被糖化外,高密度脂蛋白(HDL)也能被糖化,研究表明HDL糖化以后与细胞膜上特异受体的结合率大大降低,直接影响了由受体介导的胆固醇由细胞内向外转运,使细胞内胆固醇向外转运率可降低25%~40%。HDL糖化后的这种功能异常也可能是糖尿病患者血管硬化加速的一个因素。酶及其辅助因子中的蛋白质及氨基酸也能受到糖化反应影响,使活性降低,例如抗凝血酶Ⅲ的糖化,可以降低对肝素的亲和力,使凝血酶抑制作用显著降低。纤维蛋白溶酶的糖化,可以使纤维蛋白降解率减少,导致糖尿病患者常见到过多纤维蛋白堆积的现象。此外,溶菌酶及乳铁蛋白分子中的半胱氨酸都容易与AGEs结合,使它们抑制细菌的活性降低,从而影响了糖尿病患者的抗感染能力。

关于核酸的糖化问题也有报道,核酸与蛋白质及氨基酸之间的关系非常密切,构成核酸的嘌呤碱及嘧啶碱都是由氨基酸合成的,有的碱基部分就有游离氨基,有的核酸中还有蛋白质部分,因此核酸也能被糖化,也有AGEs结合物,糖化后的核酸可以使遗传物质发生相关的变化,包括染色体的改变、DNA链断裂以及DNA的修复、复制、转录能力降低等。有的报道认为糖尿病时能加快细胞的衰老过程,可能与此有关。关于核酸的糖化及可能造成的影响已引起广泛注意。

对血管内皮的损伤

胶原蛋白是广泛存在于人体结缔组织、各种大、小血管及全部基底膜的蛋白质,有较长的更换期,是最容易受到糖化影响的蛋白质之一。胶原蛋白质的糖化堆集和交联使蛋白质的溶解度及对酶的敏感度降低,影响了它的代谢、修复及更换。AGEs的堆集也使组织的厚度及硬度增加,弹性减少,显然这对那些心、肺、动脉等重要器官的生理功能将产生影响。Vlassara将生理量的AGE-兔血清白蛋白给予正常兔输注4个月,其中一些动物同时给予富于胆固醇的食物喂养2周,可以清楚地看出这些兔的主动脉上均有AGEs的堆集,并有内膜改变、细胞粘连及脂质沉积的病变。而未给予AGE-白蛋白的对照组动物则未见有这种动脉血管的病变发生;同时给予胆固醇饮食动物病变更为严重,动脉内膜出现含有泡沫细胞增厚的斑块及块状脂肪沫等。证明了AGEs堆集与动脉硬化的关系。在高血糖的影响下,胶原蛋白可以形成网状的AGEs堆积物,在血浆中的一些蛋白质分子,如白蛋白、免疫球蛋白、脂蛋白等渗入到血管外层时,能够与这些网状的AGEs堆集物结合,交织地附着在糖化了的胶原蛋白分子上,造成基底膜不断增厚及毛细血管和肾小球的阻塞,同时在细胞免疫系统的作用下,还构成对细胞的损害。

AGE-胶原蛋白结合物对血管内皮细胞的作用,还直接干扰NG内皮舒张因子(DERF)反应系统,并同时使NO的抗细胞增殖机制受到抑制,造成血管平滑肌舒张不良和内膜病变。国内、外实验室都报道了AGEs通过抑制一氧化氮生成在血管内皮损伤中的作用。虽然AGEs抑制一氧化氮生成的机制尚不清楚,这对研究糖尿病微血管病变机制及AGEs在并发症中的作用提供了一定的实验室依据。关于AGEs与血管紧张素转换酶的关系研究,也从另一个角度阐述了AGEs对血管张力的影响。

形成修饰蛋白质所造成的损害

AGEs的形成改变了蛋白质结构的完整性:

直接损害被糖化的蛋白质功能

血红蛋白糖化后可致氧输送能力减低;胶原蛋白、细胞外基质成分糖化交联可改变结构造成血管壁通透性改变,甚至直接导致血管壁增厚,管腔狭窄而产生大、小血管病变而导致心肾脑等器官损害;脂蛋白本身的氧化及修饰可使其清除速率减慢,造成血胆固醇水平升高,从而在动脉粥样硬化发生中起作用;髓鞘蛋白糖化可致神经传导速度减慢及发生其他神经病变;晶状体蛋白糖化是白内障发生的原因之一;糖化反应还可直接影响激素蛋白的结构而使包括胰岛素在内的激素活性下降

修饰蛋白质成为自身抗原,对机体免疫系统产生影响

既往探讨AGEs致病的病理生理机制时多涉及因AGEs形成改变蛋白质结构,使蛋白质功能本身受到影响,较少涉及因AGEs修饰蛋白质结构而使体内蛋白质成为自身抗原,刺激机体免疫系统造成损伤。近年来,2型糖尿病及其并发症发生原因与免疫系统的关系不断地被提及。特别是循环血中免疫细胞分泌细胞因子成为炎症状态与血管损伤的关系。这些细胞因子对体内脂质代谢、内皮功能都有影响。有人推测,这些细胞因子通过其对脑、肝、脂肪及血管内皮细胞的作用参与了代谢综合征以及糖尿病及其并发症的发生与发展。其中TNF-α,IL-6已被认为与机体多种病理生理过程相关。IL-6是特异抗原免疫反应及炎症反应中的多效应物质;同时也是机体急性反应中的重要生物介导物质。TNF-α更是通过其多方面效应,抑制机体抗凝,促进血栓形成,刺激垂体分泌ACTH,甚至可以直接抑制酪氨酸激酶活性。所有这些作用均被视为与胰岛素抵抗和2型糖尿病并发症发生发展有关。

笔者实验室应用自行制备的AGEs产物,分别与正常人及糖尿病患者外周血淋巴细胞共同培养24小时后发现:①AGEs确实可以刺激人体外周血淋巴细胞产生包括TNF-α和IL-6在内的细胞因子。②将受试者对AGEs刺激反应与对非特异性抗原PHA刺激反应进行比较。无论以TNF-α产生还是以IL-6产生为指标,糖尿病患者表现出对AGEs刺激较敏感的状态;这不仅表现在正常人与糖尿病患者外周血淋巴细胞TNF-α分泌平均数量的显著性差异上,也表现在患者中高敏反应者的比例为正常者的5倍以上。糖尿病患者对AGEs刺激高敏反应与性别、病程、体重及血糖水平等指标无关。通过这一方法可获知糖尿病患者个体免疫系统对AGEs刺激的反应状况。糖尿病患者中所表现出的高敏反应现象有可能是糖尿病并发症发生的危险因素,AGEs刺激后细胞因子测定也有可能成为预测糖尿病并发症发生的一个指标。但为证实这一可能,首先需要确立细胞因子产生与糖尿病患者血尿生化、病理改变及并发症发生的相关性。这将是一项大规模的前瞻性工作。

AGEs与AGEs受体的作用

体内多种细胞存在有AGEs受体,实验表明这一系统存在与AGEs的清除有关。这从某种意义上表明AGEs是机体需要及时有效清除的物质。一旦AGEs生成过多或清除不利在体内堆积过高,可能会引起病理改变。一些实验及临床证据提示AGEs受体与血管病变的关系。糖尿病或其他原因所致血管病变患者,血管内皮中AGEs受体蛋白质含量及AGEs受体mRNA水平明显增高。AGEs与细胞壁上的AGEs受体结合激活细胞内信号传导系统,刺激细胞因子分泌,产生不同的生物效应。AGE受体蛋白质的分子大约10~90kD,它们的数目可以随循环中胰岛素的增多而减少。值得注意的是具有AGE受体蛋白质的一些细胞与AGE蛋白质结合后,可促使细胞内许多细胞因子的合成与释放,如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1α(IL-1α)、胰岛素样生长因子-ⅠA(IGF-ⅠA)、血小板衍生生长因子(RDGF)及γ-干扰素(INF-γ)等。这些细胞因子除了可以促进及参与AGE的分解外,还可干扰周围组织细胞的若干功能,如细胞的趋化性、黏附性、增殖与分化、活性化以及凝固和屏障功能等,引起组织的炎性反应、免疫功能异常及循环障碍等的发生,这些作用发生在血管内皮细胞时将与糖尿病大、小血管并发症的发生与发展密切相关。众多已知的细胞因子和生长因子被认为在机体体液调节中发挥着越来越重要的作用。TNF-β,IL-1、IGF-ⅠA、PEGT这些已知可由AGEs诱导产生的细胞因子均可刺激血管内皮细胞增殖。笔者曾观察到AGEs对血管内皮细胞增生的影响,AGEs可直接刺激血管内皮细胞的增殖,这一作用较单纯葡萄糖更为明显。

直接参与基因调控表达

AGEs是一类合成后修饰蛋白,它的蛋白修饰与基因突变无关。但AGEs可在体内对基因表达发生作用。正常小鼠接受AGEs腹腔内注射4周,可使小鼠Glomerular extracellular matrix d(Ⅳ)collagen,Laminin B1,Transforming growth factorβ1 mRNA上升1~2倍。这些因子被认为与糖尿病肾病发病有关。与这些因子基因上调表达的同时,小鼠伴有肾小球肥大的病理改变。

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