荧光标记抗体

荧光标记技术是指利用一些能发荧光的物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上,利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。荧光标记技术起源于20世纪40年代用荧光标记抗体来检测相应的抗原。随着现代医学、分子生物学的发展和各种先进荧光检测技术及仪器如流式细胞仪(FCM)、激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)等的应用,荧光标记作为一种非放射性的标记技术受到很大程度的重视,并取得了迅速的发展,广泛应用于细胞内外物质检测、核酸的检测以及内分泌疾病的早期诊断等,在生物学研究领域和医学研究领域里发挥了很大的作用。

一般从特异性抗血清或抗(人及其他动物)Ig的免疫血清中提纯的IgG,或采用相应的单克隆抗体标记荧光素。

须形成稳定共价键而不影响免疫特异性

适用于抗体标记的荧光素必须与蛋白质形成稳定共价键而不影响免疫特异性。荧光是指1个分子或原子吸收了给予的能量后,即刻引起发光;停止能量供给,发光亦瞬即停止(持续10-8~10-7秒)。荧光素是一种能吸收激发光的光能产生荧光,并能作为染料使用的有机化合物。适用于抗体标记的荧光素须具备以下条件:

  1. 应具有能与蛋白质分子形成稳定共价键结合的化学基团,或易于转变成此类基团而不破坏其荧光结构;
  2. 荧光效率高,与蛋白质结合的需要量很少;
  3. 与抗体或抗原结合后,应不影响其免疫学特异性;
  4. 结合物产生的荧光颜色与背景组织的自发荧光对比鲜明,能清晰地判断;
  5. 荧光素与蛋白质结合的方法简便、快速,游离的荧光素及其降解产物容易去除。

此外,结合物在一般贮存条件下性能稳定,可保存较长时间。目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明(tetraethyl rho-damine B200,RB200)及四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isothiocyanate,TRITC)。实际上应用最广的只有FITC一种,罗丹明常作为衬比染色或双标记。

异硫氰酸荧光黄(FITC)

纯品为橙黄色或褐黄色结晶粉末,有两种异构体。其中异构体Ⅰ的荧光效率较高,与蛋白质结合更稳定,分子量为390,易溶于水和酒精等溶剂。FITC的性质稳定,低温干燥条件下可保存多年,室温下亦可保存2年以上。最大吸收光谱为490~495nm,激发产生的荧光波长为520~530nm,呈黄绿色。在碱性条件下,FITC的异硫氰基(—N‖C‖S)与抗体蛋白的自由氨基(主要是赖氨酸的ε-氨基)经碳酰胺化而形成稳定的硫碳氨基键,成为荧光素标记抗体。1个IgG分子中有86个赖氨酸残基,但最多能够标记15~20个荧光素分子。胰岛细胞抗体(ICA)检测所用的标记荧光素多采用FITC,但目前难以标准化,限制了其临床应用。

四乙基罗丹明(RB200)

纯品为褐红色粉末,分子量为580,不溶于水,易溶于酒精和丙酮,性质稳定,可长期保存。RB200的最大吸收光谱为570~575nm,激发产生的荧光波长为595~600nm,呈橙红色。由于荧光效率较低,一般不单独使用,多用于FITC的衬比染色或双标记。

四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)

亦称为罗丹明的衍生物,紫红色粉末,性质较稳定,分子量为443。最大吸收光波长为550nm,激发产生的荧光波长为620nm,呈橙红色荧光,与FITC的黄绿色荧光对比清晰。TRITC的荧光效率亦较低,但其激发峰与荧光峰距离较大,易于选择滤板系统。通过分子中的异硫氰基(—N‖C‖S)易与蛋白质的氨基结合,故较RB200使用方便,近年来较常用于双标记示踪。TRITC与蛋白质结合的方式与FITC相同。

藻红蛋白(phycoerythrin,PE)

是从红藻中提取的一种藻胆蛋白(phycobiliprotein),系天然荧光色素。最大吸收光谱为490~560nm,激发产生的荧光波长为595nm,呈现红色荧光。PE可和FITC同时用于各种抗体或配体进行双标记,在流式细胞术(FCM)中较常用。Shalhoub等采用PE标记人OPGL,用荧光活度细胞分类仪检测,发现外周血中破骨细胞前体存在NF-kappa B (RANK)。

标记抗体必须进行纯化与质量鉴定

标记抗体的纯化

主要包括:

  1. 去除游离荧光素:一般采用透析法或Sephadex G-25或G-50凝胶柱层析法。
  2. 去除未标记及过度标记蛋白:此步骤是为了消除结合物中未标记抗体蛋白的特异性抑制作用,以及过度标记蛋白所致的非特异性染色。通常采用DEAE-纤维素或DEAESephadex A-50离子交换层析法,以梯度洗脱或连续梯度洗脱,分步收集洗脱液。经过F/P比值测定或染色检查,根据需要将适合部分合并,浓缩后保存备用。但经过上述处理的标记抗体,一般约损失50%。因此,对一些抗体效价较高的制剂,可采用适当稀释的方法达到目的。
  3. 去除非期望抗体或交叉反应抗体:可以采用组织制剂(常用正常大白鼠或小白鼠的肝粉)吸收法和固相抗原吸附法。

标记抗体的鉴定

(1) 抗体效价:一般用琼脂双向扩散法测定。中央孔内加抗原(1mg/ml),抗体稀释度(效价)在1∶16~1∶32呈阳性者较为理想。

(2) 荧光素(F)与蛋白质(P)结合比率(F/P比值):测定F/P比值是标记抗体质量鉴定的重要指标之一。一般采用紫外分光光度计测定和换算的简便方法。将FITC标记抗体适当稀释,使其280nm OD值接近1.0。先在波长495nm测定FITC(F)的OD值,再于波长280nm读取蛋白质(P)的OD值。然后按下式计算F/P比值:

检查组织细胞抗原成分时,以F/P=1~2为合适;检查细菌涂片时,以F/P=2~3为合适。如用TRITC标记抗体,则按下式计算:

此比值在2.1~9.4之间均可用,但以数值较低者为佳。

(3) 特异性染色滴度测定:直接法染色时,将标记抗体做一系列倍比稀释(1∶4~1∶256),分别用于阳性标本及阴性对照标本染色。出现清晰明亮的特异性荧光(“+++”)的最高稀释度,即为该抗体的染色滴度或单位。阴性标本的非特异性染色低于特异染色滴度。实际应用时,取2~4个染色单位(即低1~2个稀释度)。间接法染色时,应将特异性抗体(第一抗体)与标记抗Ig抗体进行交叉染色测定(方阵滴定),以确定标记抗抗体制剂的平切终点(plateau end point),以“+”荧光强度为判定标准。

(4) 标记抗体的特异性鉴定:在标记抗体内加入过量的相应抗原进行吸收后,再用于阳性标本染色,应不出现明显荧光。或者,阳性标本先加适当稀释的同种未标记抗体,作用一定时间后洗去,再加标记抗体染色,应受到明显抑制。

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