过氧化物酶耦联抗体和碱性磷酸酶耦联抗体定位

采用酶标记抗体或酶标记抗抗体进行抗原-抗体反应。这种标记物可同时保留抗体的免疫特性和酶的活性。用酶标记抗体与抗原结合后,需再滴加酶的底物过氧化氢(H2O2)和供氢体——二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)。酶和底物反应后可产生有色沉淀物,借助一般光学显微镜或电子显微镜进行定位、定性研究,也可应用光电比色计或酶标仪进行定量测定。酶标记技术定位细胞内蛋白质优点:①酶-抗体复合物能够很容易地渗透入细胞内并定位在其靶位上;②反应产物能随着时间的延长而不断地积累,因而具有高度的敏感性。酶标记技术定位细胞内蛋白质缺点:①反应产物会从原始抗原的真实部位向远处扩散;②有时反应产物会遮盖住靶位的真实结构,由此产生假阳性或假阴性的结果。如果研究的问题只是要确定细胞或组织的某个区域内是否存在某种抗原,可以使用这一方法。

酶标定位细胞内蛋白应注意避免内源性酶活性的影响

虽然细胞内源性酶活性的问题并不普遍存在,但有些细胞和组织有内源性的过氧化物酶(如巨噬细胞、骨髓细胞及红细胞)或碱性磷酸酶(如胎盘、小肠),这些内源性酶活性的存在会给实验结果的判定带来影响。

如果已知或怀疑存在内源性过氧化物酶活性,可以用含有 1%乙酸的甲醇室温处理15分钟,或用含0.03%H2O2的甲醇室温处理30分钟。如果是经乙醛固定过的细胞或组织,在制作光学显微镜标本时,可用高碘酸-硼酸钠处理,以封闭内源性过氧化物酶活性(在与一抗反应之前,首先将标本用0.01mol/L高碘酸处理10分钟,随后在0.1mg/ml硼酸钠溶液中孵育10分钟)。标本用缓冲液漂洗后再进行定位检测。内源性碱性磷酸酶活性可以通过在底物混合液中加入左旋咪唑来加以封闭。

如果对过氧化物酶反应产物判断不清,可以在DAB底物溶液中加入镍或钴等金属盐,会使反应更为敏感,此时反应产物呈紫色或黑色。首先用水配制8% NiCl2贮存液,再按每0.5ml DAB溶液(0.5mg/ml)加入4μl 8%NiCl2贮存液进行孵育,最后加3μl 2%H2O2使反应进行。(黄干)

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