基因诊断技术

传统的临床诊断是建立在临床症状、体征的诊断标准、生化检验及一些影像辅助检查的基础上的。临床诊断标准可能模棱两可,而且不少疾病早期的症状和体征不明显或缺乏特异性,很难依据临床表现来诊断。生化检验结果同样可能出现模糊的情况,需要进一步进行侵入性或费用昂贵的检查才能明确诊断。而在鉴别疾病携带者或需做产前诊断时,传统的临床诊断标准更存在严重的局限性。

分子生物学技术运用于临床诊断而产生的基因诊断技术基本上避免了上述弊端。基因诊断是指在基因水平上,直接检测患者遗传物质的改变,对疾病作出诊断的过程。根据遗传中心法则,遗传基因(DNA)按照碱基互补配对原则转录为mRNA,mRNA翻译成蛋白质,决定机体各种蛋白质的结构及功能,从而表现出千姿百态的生命现象。人类基因位于染色体上,每对染色体上相同位点上的基因称为等位基因。在内外因素的作用下,人的生命(即受精卵形成,胚胎发育到出生后的个体发育、生长、衰老)过程中的每个基因都有产生突变的可能,突变导致基因的结构的变化和表达调控的异常,最终表现为疾病携带者或疾病患者。因此有必要对这种疾病的结构或功能的改变作出准确的诊断,以便针对病因对疾病作出及时的治疗。基因诊断具有高特异性,能明确判定受累患者或携带者有无基因突变;也具有高灵敏性。基因诊断所需的DNA标本可从任何一种有核细胞中获得,如果采用PCR方法,甚至几根头发、1滴血迹、几个细胞,即可作出判断。基因诊断还能在临床症状出现之前即对疾病个体作出判断,而且通过诊断还可为患者提供有关其疾病的预后信息。同时,根据遗传规律也可对易感人群和疾病基因携带者进行病前甚至产前诊断(prenatal diagnosis)与筛选。基因诊断使得产前诊断及携带者的筛查成为可能。当然,基因诊断也存在局限性,其原因在于遗传改变的异质性。

在分子水平上,一些疾病是相对均质性的。不同的患病个体可有不同的突变类型,即为遗传异质性(genetic heterogeneity)。有些疾病中甚至每两个患者之间的遗传改变都各不相同,这种异质性阻碍了将统一的基因诊断方案用于某种疾病的所有病例中,从而使基因诊断方法复杂化。但是,对遗传性疾病而言,基因诊断是必须的,只有基因诊断才真正做到了疾病的分子诊断与鉴别诊断,才能真正做到从基因结构和功能的本质上阐述病因。目前,基因诊断技术主要应用于单基因遗传性疾病的诊断,如遗传性垂体功能减退症;而对于多基因遗传性疾病,除非该种疾病致病的1个或多个主基因已经非常清楚,否则基因诊断的意义不大。因此,在对某种疾病进行基因诊断前,我们必须掌握该疾病的遗传方式。

骨组织的吸收、形成和骨量的维持受许多激素、生长因子与转录因子的调节。其中上皮生长因子(epidermal growth factor receptor,EGFR)和激酶受体(kinase receptors)系统在成骨细胞、破骨细胞和软骨细胞的增殖与分化中起了重要作用。

用于产前诊断和易感人群筛选及致病基因鉴定

基因诊断的直接途径即直接分析基因结构或序列及其表达是否正常,需要满足下述的必要条件:①已知被检基因的突变类型与疾病的发病有无直接因果关系;②被检基因的正常的分子结构或序列已被确定;③已知被检基因突变的位点。

1. 基因缺失(deletion)

指基因中某些碱基对丢失。缺失可以是整个基因的缺失。如果缺失足够大,用显微镜分析中期染色体标本就可看到,如果缺失太小以致常规显带不能看到,则可用荧光原位杂交等方法检测。在更多的情况下,缺失的基因很小或基因缺失的部分很小就需用进一步的方法如PCR等来确定。

2. 基因插入(insertion)

指某些基因插入了1个或几个碱基对,缺失和插入可能导致基因的阅读框架改变,在翻译水平引起多肽链的变化。

3. 基因点突变(point mutation)

指基因中1个或1对碱基的改变。上述这些基因突变可发生于基因的编码顺序或调控顺序中,打断了正常的阅读框架,因此产生被截短的蛋白质、延长的蛋白质或无功能的蛋白质等,都将使相应的遗传性状发生改变或产生新的性状,导致疾病的发生。值得注意的是,就基因突变可能造成对表型的巨大作用而言,基因突变是非常细微的。1个基因内几千个碱基中有1个改变就可以打断进而改变或清除基因产物的表达。但在另一方面,人类遗传的变异是十分普遍的,而且通常不会引起表型效应,良性的变化可能发生在基因的某些区域,这些区域本身不参与编码蛋白质,亦不改变基因编码的蛋白质的性质,因而基因诊断亦可鉴别这些良性多态性与致病的突变。

诊断单基因遗传病应首先确定遗传方式

获取有关疾病的遗传流行病学信息是非常重要的,其中最重要的流行病学参数是亲属风险性λR。λR等于患者亲属的发病风险除以整个人群的发病风险。下标R代表亲属的类型,如λD代表子代的发病风险,λs代表同胞的发病风险。λR的大小代表了亲属与患者具有共同遗传决定因素的程度,在致病基因定位中,λs越高,找到致病基因的可能性越大。但单凭疾病在家族中聚集推断疾病具有遗传性并不准确,巴布亚新几内亚发现的枯鲁氏病是个很好的例子。枯鲁氏病是一种由朊病毒引起的神经系统疾病,它在家族中聚集,并以女性多见,故常被认为是一种常染色体显性遗传病,以女性为主,其λR达51,但最终人们发现这种家族聚集现象是由该地区妇女儿童食葬的习惯造成的慢性病毒感染,放弃食葬习惯后,此病明显减少,证明此病完全是由环境因素而非遗传因素所致。因此除家族聚集研究外,确定疾病是否具有遗传基础,还应进行双生子和领养子研究。

寻找和克隆单基因遗传病致病基因需经过多个步骤

当某一疾病经过流行病学研究确定为单基因疾病后,往往采取定位候选克隆策略来寻找该疾病的致病基因。定位候选策略以致病基因的染色体定位及相应染色体区域的物理图谱为基础,研究该区域内已知基因、开放阅读框架(ORF)、EST或cDNA片段与疾病的相关性。此策略大体包括3个步骤。

1. 将致病基因定位到染色体某一区域

即确定疾病基因在染色体上的精确位置。如果患者具有染色体大片段缺失、插入或易位等明显的细胞遗传学特征,或有足够多的家系,可以通过连锁分析将基因精确定位在染色体上。连锁分析指的是根据基因的重组率来计算两基因之间在染色体上的距离。连锁分析的基本原理是:在配子形成过程中,两个基因或标志被一起分配到子代,而不发生交换,称为连锁,两个位点发生交换的可能性大小用重组系数(θ)来表示。这两个基因被一起分配至子代的可能性大小反映了这两个基因的遗传学距离。重组系数越大,基因间的距离越远。基因的遗传距离单位为cM,即用重组系数的百分数表示,如重组系数为1%,则距离为1cM,若基因间距离>50cM,则不存在连锁。常用连锁分析方法是对数优势记分法,两对(或两对以上)等位基因以某一重组率连锁时,产生所观察到的家庭与不存在连锁情况下产生该家庭的概率之比的对数,称为Lod记分。取不同的重组率θ,得到一系列Lod记分值,对应最大Lod记分的θ的值,即为该座位的最大似然估计值。Lod记分的遗传学意义可以理解为某一重组率时,存在连锁的概率与由机会造成非独立分离的比值的对数。当Lod值>1时,有可能存在连锁,若Lod>3肯定为连锁,Lod<-2可否定连锁。运用Lod法进行连锁分析可将多个家系的资料合并处理,还可以得到多态性位点与其存在连锁的基因之间的遗传距离(基因定位)。

2. 从数据库中搜寻定位于该区域内的所有已知基因、ORF、EST或cDNA片段

将其功能结构与患者的生化缺陷、基因表达的时空特异性与受累组织、基因表达的发育阶段特异性与发育缺陷、基因的印迹表达与疾病的印迹遗传、基因序列的不稳定性与遗传的表现等进行分析和比较,找出候选基因。

3. 筛查致病基因

确定该基因是否发生结构异常,以及这种结构变化是否导致功能改变,进一步确认该候选基因为致病基因。相反,如果知道一个ORF或者较为完整的cDNA片段在染色体某一区域的定位,也可以将定位在这一区域内的所有遗传性状或疾病的生化、遗传、病理等特征与新分离基因的结构和表达特征进行比较,确定该基因的功能。筛查致病基因的方法主要有以下几种:

  1. 基因突变分析:是这一步骤的关键技术,可用于各种分子遗传病的基因诊断。
  2. DHPLC加荧光SSCP法:Dobson-Stone等用DHPLC加荧光SSCP法(F-SSCP)筛选遗传性多发性外生骨疣(hereditary multiple exostoses,HME)的EXT1和EXT2基因,发现85%的病人存在突变,EXT1突变者占76%,EXT2突变者占24%,DHPLC和F-SSCP的检出率分别为95%和93%,前者不能鉴别同一片段中的差异序列,但F-SSCP弥补了这一不足。
  3. 杂合双链分析法:由突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一个起点,在非变性胶中电泳时,会产生与相应的同源双链DNA不同的迁移率,从而使两者分离。该方法的原理与单链构象多态性(SSCP)相似,不过SSCP分离的是单链,而HI法分离的是双链。
  4. 单链构象多态性(SSCP)原理是利用单链DNA在中性条件下会形成二级结构,这种二级结构依赖于其碱基的组成,即使有一个碱基差异,也会形成不同的二级结构并引起在非变性电泳条件下不同的电泳迁移率。
  5. DNA测序:由各种突变检测技术检测到的突变最后都得由测序来确定突变类型及突变位点,而这种测序检测突变的效率达100%,因此,对一些具有较小外显子的小基因的突变检测可直接用测序法完成。除上述这些方法以外,还有化学切割错配、酶促切割错配、切割片段长度多态性以及错配接合蛋白检测等。

根据要求选用不同的有核细胞样本

一般用外周血淋巴细胞作为抽提DNA的主要原料。采集时,先抽取抗凝的外周血,再分离白细胞,也可直接用试剂盒对全血中DNA快速抽提,原始材料较少或较难获得时,须经过细胞培养技术获得足够数量的培养细胞,也可采取无创性的方法采取样本,采集口腔黏膜上皮细胞或发根毛囊细胞。如产前诊断则需采集胎儿的羊水细胞或绒毛膜上皮细胞。绒毛采集(chorionic villi sampling)时间一般为妊娠8~12周。1mg湿重绒毛可获得1.6μg左右的DNA。将采得的绒毛组织在PBS中洗涤数次,在倒置显微镜下去除任何可疑的非绒毛组织,将绒毛在滤纸上吸干,称重,然后冰冻处理,如果不立即提取DNA,可低温保存。若错过绒毛采集时机,可采集羊水,羊水采集量约20ml。血性羊水不能直接用于产前诊断,需进行离心后体外培养。因血液细胞不能贴壁生长,多次换液去除母体细胞后,可抽提DNA以供基因诊断,一般而言,20ml羊水可获得7μg的DNA。对于需对照发病前后情况或做家系分析者,则需要采集不同时期的样本以做DNA抽提,甚至需要留取整个家系成员的标本。对肿瘤的诊断有时还需要采取瘤体组织。由于后天环境因素的影响,部分疾病基因存在遗传异质性和体细胞突变,这时需采取病变部位的体细胞标本,抽提体细胞的DNA。如做表达分析,则收集新鲜的组织块来抽提RNA。

全血DNA的抽提应用较多。将全血分离出白细胞后,用蛋白酶K消化各种蛋白质,再用苯酚、氯仿等蛋白变性剂使蛋白溶解,回收上清液中的DNA,再用乙醇沉淀,即得到DNA。

RNA的抽提易被RNA酶降解,故其操作较DNA抽提过程需要更加细心。所用水和溶液须经RNase灭活剂——二乙基焦碳酸(DEPC)处理,玻璃器皿300℃烘烤4小时,一般器皿用0.2% DEPC溶液浸泡后高压灭菌,塑料器皿可用氯仿冲洗,不耐氯仿的器皿则用DEPC处理过的水反复冲洗。操作RNA时必须戴手套,RNA抽提可采用简单的异硫氰酸呱/酚法或使用商业提供的Trizol试剂。一般将新鲜或冻存的组织块切碎称重,外周血分离白细胞,迅速加入异硫氰酸呱/酚溶液中,组织块液氮中研磨,加入氯仿,剧烈混合后,回收上清液中RNA,再加异丙醇浓缩离心沉淀即得。

基因表达检测为病因和发病机制提供合理解释

Northern杂交在基因诊断中主要是用于检测基因表达水平的变化。从组织或细胞抽提得到mRNA后,经变性琼脂糖凝胶电泳分离的RNA转移至固相支持物如硝酸纤维素膜或尼龙膜上,再与放射性标记的探针和固定在膜上的RNA进行杂交,然后放射自显影,根据杂交带有无、杂交带的浓度等可判断基因表达的情况。此外,也可使用反转录PCR方法进行检测。

以上各种方法是建立在疾病的致病基因或相关基因突变已知的基础上进行的基因诊断,而对于那些致病突变尚未确定的基因诊断可用连锁分析的间接途径来完成。连锁分析之前,需要了解疾病基因在基因组中的位置,最好是已经克隆的基因,这样利用与基因紧密连锁或位于基因内的多态性DNA顺序标记来追踪家系中该基因的传递特征。此外,还需要了解疾病的遗传方式、疾病基因性状是显性还是隐性,而且只有两代或两代以上受累家系成员以及父母至少一方为杂合子,才能使用连锁分析做基因诊断。连锁分析用的标记应具有易检出性和高度多态性,这些标记包括限制性片段长度多态性(RFLP),但由于它的多态性不丰富,且操作较繁杂,故目前更多地倾向于使用多态性更高,且可使用PCR方法进行的DNA顺序多态性标志进行检测,或微卫星标记以及新近大量使用的单核苷酸多态性标志(SNPs)等。

利用多态性标志进行连锁分析可同时选用2个以上的多态标记以获得更多的信息供基因诊断用。随着越来越多的致病基因被阐明,人类疾病的基因诊断将越来越成熟,更多确实可行的方法也将会不断涌现。

基因突变诊断主要适用于孟德尔遗传病

DNA突变分析有助于临床诊断。当特定基因被确定为特定疾病的病因时,DNA突变分析可辨别特定突变类型是否传递给胎儿,决定是否终止妊娠。此外,当表型在两种综合征中重叠时,突变分析有助于确定其病因诊断。

突变分析主要适用于孟德尔遗传性疾病的诊断。引起某种疾病表型的突变类型可以发生在一个基因内,也可以发生在非编码区。许多基因很大,并且突变性质在个体间存在明显差异。确定致病性突变需要对整个基因进行测序,需要测试的候选基因规模庞大,但应用最新技术可以实施突变分析。NIH资助网站(www.genetests.com)定期升级实验数据库和相关综述,提供某一特定疾病的遗传信息。

FISH可用于检测染色体异常,比较基因组杂交(comparative genomic hybridization,CGH)淘汰了过时的细胞遗传学技术。基于微阵列的比较性基因杂交技术可检测基因拷贝数量和染色体微缺失,快速而DNA样本量少。一些商业公司已经提供了带有DNA探针的专用基因芯片,可以就单一DNA样本检测许多疾病。

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