生物素-亲和素系统提高示踪免疫分析特异性和灵敏度

生物素-亲和素系统(biotin-avidin System,BAS)是20世纪70年代后期应用于免疫学,并得到迅速发展的一种新型生物反应放大系统。由于它具有生物素与亲和素之间高度亲和力及多级放大效应,并与酶等免疫标记技术有机地结合,使各种示踪免疫分析的特异性和灵敏度进一步提高。

生物素(biotin,B)广泛分布于动、植物组织中,常从含量较高的卵黄(α型)和肝组织(β型)中提取,α、β两型的生物活性基本相同,现已可人工合成。生物素在机体内以辅酶形式参与各种核化酶反应,故又称为辅酶R或维生素H。分子量为244.31,分子式为C10H16O3N2S,有两个环状结构,其中,Ⅰ环是咪唑酮环(亦称ureido环)与亲和素结合的主要部位;Ⅱ环是噻吩环,C2上有一戊酸侧链,其末端羧基是结合抗体和其他生物大分子的唯一结构。

利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物,称为活化生物素,以适合与各种生物大分子结合的需要。主要有用于标记蛋白质氨基的生物素N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)和生物素对硝基酚酯(pBNP),其中以BNHS最常用。近年来,应用活化长臂生物素(BCNllS)标记生物大分子,可以减少位阻效应,增加检测的灵敏度和特异性。用于标记蛋白质醛基、巯基和糖基的衍生物有生物素酸肼(BHZ)及肼化生物胞素(BCHZ)。

亲和素(avidin,A)是一种碱性糖蛋白,可由蛋清中提取,分子量60kD,每个分子由4个亚基组成,可以和4个生物素分子亲密结合。由于从蛋清中提取的亲和素与聚苯乙烯吸附很强,如用于ELISA中可使本底增高,现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉亲和素(streptavidin)。亲和素与生物素的结合,虽不属免疫反应,但特异性强,亲和力大,两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置,可以连接更多的生物素化分子,形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELISA耦联起来,就可极大提高ELISA的灵敏度。

生物素-亲和素系统多用SA标记酶结合物

SA的等电点较低(pI=6.0),表面所带正电荷少,且不含任何糖基,在实验中出现的非特异性结合远低于一般亲和素。因此,当今免疫学检测使用的BAS试剂大多改用SA标记的酶结合物。

生物素-亲和素系统用于类固醇激素检测

许多类固醇激素的免疫分析通常采用类固醇衍生物制备的抗体,这些类固醇衍生物含有连接免疫原性蛋白质的半琥珠酸酯或羧甲基肟桥链。碘化的类固醇衍生物或连接酶的衍生物通常利用相同的桥链与碘复合物或酶相连接。然而,抗体对桥链的识别带来了空间位阻等问题,尽管采用高特异活度的碘示踪物或高活性的酶,与氚化类固醇相比,检测敏感性低。目前,为了解决这个问题,采用了如导入半抗原等异源物、桥联异源物、应用立体异构体和不同耦联步骤以及不同标记物产生位点异源性等来改变联结物与免疫原结构。直接酶、荧光、化学发光标记类固醇尽管有良好的检测限,但有着严重的缺陷,而采用生物素和链霉亲和素系统可以避免这个缺陷。

生物素-链霉亲和素技术在类固醇激素检测上有两种应用方法,一种是作为检测系统,其中结合生物素化抗原的抗体通过链霉亲和素报告分子被检测到;第二种是作为分离系统,其中链霉亲和素包被平板用于生物素化Ag/Ab的固化。目前的研究阐明,与采用高分子量的辣根过氧化物酶(HRP)相比,采用联结低分子量的亲和素标记异源性抗原能提高半抗原分析的灵敏度和特异性。研究发现,采用高分子量HRP标记导致与皮质甾酮产生100%的交叉反应。而采用低分子量的生物素标记,与皮质醇所有的类似物(包括皮质甾酮等)交叉反应小于0.1%,而且分析灵敏度(0.09μg/dl)也得到提高。与放射免疫分析法相关程度高。

Nara等采用皮质醇-3-O-羧甲基肟-牛血清白蛋白(F-3-CMO-BSA)获得皮质醇抗血清。应用生物素标记的皮质醇作为初级探针,链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(SAHRP)作为第二探针用以监控抗原抗体反应。25μl血清样品与100μl生物素化的皮质醇(F-3-CMO-biotin)在包被皮质醇抗体的微孔平板中室温反应1小时。洗涤后,加入100μl SA-HRP室温反应20分钟,再次洗涤后,加入基质四甲基联苯胺/过氧化氢。生物素-链霉亲和素系统的参与,增加了皮质醇分析的灵敏度和特异性。低分子量初级标记物(F-3-CMO-biotin)的使用,有利于与血清中皮质醇竞争抗体的抗原结合位点,因此可获得3.42ng/ml的良好检测限。

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