酶结合物是酶免疫测定试剂盒的核心组成部分,最易受外环境影响。通常酶免疫测定试剂盒的有效期是根据酶结合物的稳定性而定的。此外,酶结合物的质量也是影响试剂盒质量的很重要的因素之一。酶-蛋白的耦合方法可分为3大类,即:

  1. 酶与蛋白的随机共价交联方法,如戊二醛方法;
  2. 通过特定化学基团进行共价交联的方法,如过碘酸钠方法及采用各种均一和非均一双功能交联剂的方法;
  3. 通过非共价键交联的方法,如酶-抗酶免疫复合物方法。

这些方法各有其优缺点,如戊二醛方法,由于交联的随机性,所得到的酶结合物大小不一,多超过1000kD。这样的酶结合物的酶活性与游离酶相比,将大大降低。此外,大分子的酶结合物在免疫测定中还有可能对测定形成空间位阻。使用过碘酸钠方法制备酶结合物,操作简单,所得到的酶结合物大小合适,酶的活性可以保留80%以上。

影响化学交联反应过程和酶结合物产率的因素较多,主要有:

  1. 待交联的分子的浓度(遵循质量作用定律);
  2. 蛋白浓度较低时,分子内交联与分子间交联增加的相对比;
  3. 待交联的两种分子浓度比;
  4. 交联试剂与两种分子的相对反应比(均一的多聚体比非均一的多聚体);
  5. 交联试剂的有效浓度,其活性依赖于诸多参数,如pH值、反应基质等;
  6. 缓冲液的纯度及其成分与交联试剂的反应性;
  7. 生物学活性基团的保护等。

戊二醛交联适用于酶-抗体系统

戊二醛[glutaraldehyde,CHO-(CH23-CHO]是一种常用的同型双功能交联剂,它的两个醛基可分别与HRP(E)和抗体蛋白(P)氨基形成Schiff碱(—N‖C—),将两个分子以5碳桥连接。戊二醛连接反应是最温和的交联反应之一。可在4~40℃温度范围,pH6.0~8.0的缓冲液中进行,分为一步法和二步法。一步法是将酶和待标记抗体混合,同时加入戊二醛,进行交联反应。此法操作简便,适用于各种酶-抗体(抗原)系统。但由于不同的酶所含氨基的数量不同,其交联产物不均一,除形成酶-抗体结合物外,酶与酶、抗体与抗体之间也可发生交联。并且不同酶的交联率也不相同,HRP的交联量一般仅6%左右。二步法是先用戊二醛处理酶,形成酶-戊二醛结合物,经过透析或层析除去未结合的戊二醛,然后再与抗体结合。酶结合物的质量较均一,产率亦可提高到13%。

改良过碘酸钠法是有效的糖-蛋白耦联方法

Nakame和Kawaoi于1974年设计了这种可用于糖蛋白且极为有效的化学耦联方法,后来又有人对此进行了改良,改良后的方法是目前用于HRP标记抗体或抗原的最常用方法。其原理是HRP分子中与酶活性无关的糖基被过碘酸钠(NaIO4)氧化为醛基,再与抗体蛋白的氨基形成Schiff碱。为了防止酶蛋白的氨基与醛基反应发生自身耦联,在标记前先用2,4二硝基氟苯(DNFB)封闭酶蛋白中残存的α-和ε-氨基。酶与抗体的结合反应后,再加入硼氢化钠(NaHB4)还原成稳定的结合物。

过氧化物酶-抗过氧化物酶复合物提高免疫酶灵敏度

此法不用任何化学交联剂处理酶和抗体,两者活性不受化学反应的改变和损伤从而可使免疫酶法的灵敏度大为提高。将HRP与其特异性抗体结合制成可溶性PAP复合物,常作为免疫组化和检测微量抗原常用的生物试剂。Shin等采用多层PAP法与生物素-亲和素法进行了比较,发现多层PAP法比单层PAP及生物素-亲和素法的灵敏度更高。

碱性磷酸酶标记使酶和抗体蛋白的氨基分别与戊二醛的醛基结合

应用碱性磷酸酶(AP)标记抗体,一般采用戊二醛作为交联剂,使酶和抗体蛋白的氨基分别与戊二醛的两个醛基结合。

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