ELISA的基本原理及试剂

基本原理

将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面,用酶标记的抗原或抗体与被固定的相应抗体或抗原发生特异性反应,反应在固相表面进行,用洗涤法将液相中的游离成分洗除,加入酶底物及色原后显色。根据方法和步骤不同分为以下几种基本反应模式。

间接法

间接法是检测抗体最常用的方法。将特异性抗原包被于固相载体上,形成固相抗原,洗涤除去未结合的抗原及杂质;加待测样本,其中的特异性抗体与抗原结合,形成固相抗原抗体复合物,洗弃未反应成分;加酶标记抗体,使在固相载体上形成抗原-待测抗体-标记抗体(或SPA)复合物;洗涤后,加酶底物或色原显色,在一定波长下测吸光度(A)值判定待测抗体的水平。

竞争法

用于检测待测样本中未知抗原或抗体。以测定抗原为例,受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合,因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量成反比。将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体;待测孔中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液,使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原,则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原,则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合,竞争性地占去了酶标抗原与固相抗体结合的机会,使酶标抗原与固相抗体的结合量减少;加底物显色,待测溶液抗原量越多,则被结合的酶标抗原量越少,呈色越浅。

双抗体或双抗原夹心法

将已知的特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体,洗涤除去未结合的抗体及杂质;加待测样本,使之与固相抗体接触反应一段时间,让样本中的抗原与固相载体上的抗体结合,形成固相抗原复合物,洗涤除去其他未结合的物质;加酶标记特异性抗体,使在固相上形成包被抗体-待测抗原-酶标抗体复合物,彻底洗涤未结合的酶标抗体,此时固相载体上带有的酶量与标本中待测物质的量成正相关;加底物显色,夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物,根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

捕获法

血清中某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在,后者会干扰IgM抗体的测定,因此测定IgM抗体多用捕获法。将抗人IgM抗体包被于固相载体上,形成固相抗人IgM,洗涤;加入待测的人血清标本反应后,血清中的IgM抗体被固相抗体捕获,洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分;然后加入特异性抗原试剂,它只与固相上的特异性IgM结合,洗涤;再加入针对特异性的酶标抗体,使之与结合在固相上的抗原反应结合;洗涤后加酶底物及色原显色,在一定波长下测吸光度(A)值判定待测抗体的水平。

生物素-亲和素ELISA(ABS-ELISA)

亲和素是一种糖蛋白,每个分子由4个亚基组成,可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉亲和素。生物素又称维生素H,用化学方法制成的衍生物,生物素-羟基琥珀亚胺酯(BNHS)可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素的产物。亲和素与生物素的结合,虽不属免疫反应,但特异性强,亲和力大,两者一经结合就极为稳定。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来,就可大大提高ELISA的敏感度。亲和素-生物素系统在ELISA中的应用有多种形式,既可用于间接包被,亦可用于终反应放大。

试剂

目前ELISA试验均有商品化的试剂盒,不需自己配制。试剂盒通常使用的试剂有以下几种。

一、标记用酶:目前常用的有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)等,其中以HRP应用最广。

二、酶底物与色原:

  1. HRP的底物:HRP的底物是H2O2或(过氧化脲),催化时需要供氢体参与,后者多为还原性染料,通过反应生成深色或有荧光的氧化性染料。HRP可用的色原(供氢体)很多,常用的供氢体有邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)等。
  2. AP的底物:AP为磷酸酯酶,一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)作为底物,产物为黄色的对硝基苯酚,在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后,黄色可稳定一段时间。AP也有发荧光底物(磷酸4-甲基伞酮),可用于ELISA荧光测定,敏感度高于用显色底物的比色法。

三、洗涤液:Tris-HCl-Tween 20缓冲液:Tris 2.42g,1mol/L HCl 13ml,0.05%Tween 20,加蒸馏水至1000ml。

四、终止液:HRP反应终止液一般采用为2mol/L硫酸,AP用NaOH终止。

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