蛋白质检测技术

酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 这一方法的基本原理是:

  1. 使抗原或抗体结合到某种固相载体表面,并保持其免疫活性。
  2. 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体,这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性,又保留酶的活性。常用的酶包括过氧化酶和碱性磷酸酶。

ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂:

  1. 固相的抗原或抗体;
  2. 酶标记的抗原或抗体;
  3. 酶作用的底物。

在测定时,把受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后,底物被酶催化变为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。例如测定皮肤细胞或组织中板层素(laminin)的含量,可用柱层析法从皮肤细胞抽提物中提取板层素,多种蛋白质将从层析柱中冲洗下来形成多种蛋白混合液。混合液中板层素的含量可以用竞争ELISA的方法测量。其原理是皮肤样品中的板层素和一定量的酶标板层素竞争与固相抗体结合。样品中板层素含量越高,结合在固相上的酶标板层素愈少,最后的显色也愈浅.ELISA的光强度读数越低。使用已知浓度的板层素纯溶液得到标准曲线,通过标准曲线比较法可以定量测定板层素浓度。

Western免疫杂交

Western免疫杂交的原理是将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维素或PVDF膜上,然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应,洗涤去除没有结合的特异性抗体后,加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体,反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体,加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等,观察有无特异性蛋白条带的出现,也可通过条带的密度大小来进行特异性蛋白的半定量。

十二烷基亚硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS-PAGE,蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一。电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象。根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳、淀粉凝胶电泳及聚丙烯酰胺凝胶电泳。SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,广泛用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构。电泳样品在沸水中煮3~5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物。SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚并形成榛子状结构,稳定地存在于均一的溶液中。

SDS-PAGE依据其分子量的差异分离蛋白质。细胞或皮肤组织中含有大量蛋白质,具有不同的电荷和分子量。在强阴离子去污剂SDS和巯基乙醇作用下,通过加热使蛋白质解离,大量的SDS结合蛋白质,使其带相同密度的负电荷,在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)上,不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品可用考马斯亮蓝染色,然后经过多次脱色可得到清晰蛋白质条带,凝胶经摄像后可进行蛋白质的定性和定量分析。

免疫沉淀技术

在Western印迹杂交中,抗体与变性的目标蛋白结合。一些抗体只能识别二级和三级结构完整的未变性蛋白,无法识别变性蛋白。因此有些抗体不适用于Western免疫杂交,但能用于ELISA和免疫沉淀。在ELISA和免疫沉淀方法中,抗体与未变性的天然蛋白结合。

免疫沉淀反应(lmmunoprecipitation)使用抗体测定特异性蛋白并能使蛋白沉淀,主要用于抗原或者抗体的定性检测。其原理是可溶性抗原(如血清中的蛋白、组织浸出液、细胞裂解液等)与相应抗体在有电解质存在的情况下,在溶液中或凝胶中结合,并按适当比例形成可见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀试验主要包括絮状沉淀试验、环状沉淀试验和凝胶内的沉淀试验。在皮肤学研究中,这种方法可用于检测某表皮或真皮细胞是否能合成某特定蛋白质并检测在不同状态下合成蛋白质的水平,例如在添加表皮生长因子的情况下。当合成的蛋白质含量很少的情况下,细胞培养液可用放射性氨基酸标记,例如蛋氨酸和脯氨酸,在细胞合成蛋白质的过程中,这些放射性氨基酸将整合到蛋白质中。蛋白质混合物进行免疫沉淀和用SDS-PAGE进行分离后,凝胶上蛋白质条带可用X射线检测,条带强度可用于免疫沉淀的定量分析。

蛋白质定量分析方法

在以上叙述中,我们讨论了从组织和细胞提取物中检测某特定蛋白的方法,而不是测定总蛋白的含量。蛋白质定量分析可以用比色法进行,常用的方法如下:

  1. Bradford法:Bradford与蛋白质四级结构特殊氨基酸结合,由棕色变成蓝色,在595 nm检测。该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的,但不使用于小分子碱性多肽的定量,如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果,如TritonX-100、SDS及NP-40等。
  2. Lowry法这种检测方法的原理是基于Cu2+与蛋白作用生成的Cu+与双缩脲试剂形成蓝色络合物,菲林试剂可用于增强蓝色形成,最终的反应物在750 nm检测。
  3. 紫外分光光度法检测原理是因蛋白质样品在280 nm波长下有最大吸光率,最大吸光率主要取决于酪氨酸和色氨酸的存在。对于含有核苷酸的蛋白质溶液用这种方法测定时需要校正。

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