皮肤细胞培养实验技术介绍

细胞培养

生物学观察通常受多种因素影响,如细胞、组织、连接组织、细胞因子、血液因子以及可溶性细胞调节物。为了使复杂的机制简化和控制可变因素,可从组织中分离细胞并进行体外细胞培养和扩增。细胞培养是指从机体组织取出细胞模拟体内环境,在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下,使其生长繁殖,并维持其结构和功能的一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞或细胞群。人体皮肤由多种细胞组成,主要的细胞类型包括表皮角质生成细胞、真皮成纤维细胞和血管内皮细胞。这三类细胞可从一个4mm2皮肤活检组织上分离得到,并进一步在细胞培养皿上生长和扩增。细胞培养技术可用于发现细胞因子、生长因子、细胞外基质以及其他成分,并进一步分析它们影响哪一类细胞的生物学性状。细胞培养技术也可用于检测哪一类细胞能合成和分泌上述生物因子,并研究这些因子对细胞功能的影响。目前,细胞培养技术还用于培养和扩增自体或异体皮肤细胞,用于大面积烧伤或严重损伤时皮肤移植。

体内、外细胞的差异和分化:细胞离体后,失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响,生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中,分化现象减弱,形态功能趋于单一化。生存一定时间后或衰老死亡,或发生转化获得永生性,变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。因此,培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体,它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能,也有一些不同于体内细胞的性状。体外培养的细胞分化的表现和在体内不同。细胞是否表现分化关键在于是否存在使细胞分化的条件。例如,表皮角质生成细胞在低钙培养液中保持在基底层增生状态,高钙则可诱导其终末分化。因此,研究者应尽可能模拟体内环境进行细胞培养研究。如果试验结果是从细胞培养皿上的单层成纤维细胞获得的,应作进一步体外皮肤培养、活体皮肤移植或动物自身试验。

细胞计数及分裂检测

细胞计数法:细胞计数法是简单且节约的方法。先将培养的细胞从培养皿上分离(一般用胰酶打断细胞一基质间的联系,用EDTA可以打断细胞一细胞间的连接),然后用血细胞计数器或自动细胞计数仪进行计数。

胸腺嘧啶结合法:DNA合成是细胞分裂的前提。胸腺嘧啶(T)与腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)及胞嘧啶(C)是合成DNA链的四种核苷酸。通常将3H或35S标记的胸腺嘧啶加入细胞培养液中,培养一段时间后抽提细胞核DNA,然后用放射闪烁计数仪检测3H或苓量。检测所得3H或玛量与细胞DNA合成及分裂成正比。

细胞核抗原检测法:正在分裂的细胞表达一种称为增生细胞核抗原蛋白(PCNA).因此可以用PCNA抗体去检测细胞或组织切片中PCNA蛋白。当PCNA抗体与PCNA蛋白结合后,再与免疫荧光、过氧化酶或经标记的第二抗体作用。只有正在分裂的细胞染色会呈阳性,可以用显微镜检测出。Ki67也是一种正在分裂细胞核内的抗原,也可用于这种抗原抗体结合染色法作细胞分裂的检测。

细胞-基质相互作用的研究方法

细胞应对细胞外基质成分表达某些整合素受体,而这些受体则可指导细胞的生物学行为,包括细胞黏附、伸展及移行。表皮基底层角质生成细胞与基底膜带之间的相互作用就是一个很好的例子。

细胞黏附试验:通常将某种细胞外基质成分固定在培养皿的底面,然后加入悬浮细胞并让细胞黏附其上。培养1-4小时后,黏附的细胞数可以用血细胞计数器或自动细胞计数仪进行计数。或者用结晶紫染细胞核并用稀乙酸将细胞破膜,然后再用比色法和紫外分光光度计进行检测。黏附细胞越多,结晶紫所染的细胞核越多,颜色就越深,读数也就越高。

细胞伸展试验:细胞伸展试验与细胞黏附试验相似,不同处在于孵育时间因相对较短,另外还需在显微镜下观察细胞形态。黏附的细胞伸展它们的胞质,显微镜下体态变扁长且颜色加深。

细胞移行或移动性试验:细胞黏附及细胞移行是两个相关且独立的过程,细胞移行较复杂。细胞在细胞外基质上移行过程包括细胞向前伸出伪足,黏附在细胞外基质上,然后细胞尾部的伪足再与细胞外基质断开。这些过程中牵涉到金属蛋白酶的作用,细胞亦分泌不同的细胞外基质,以及细胞表面出现不同受体的表达。如下是几种常用的细胞移行试验:

  1. Boyden小室细胞移行试验:Boyden小室上下由膜分开,试验时将细胞加到膜上室,而将可溶性化学趋化剂加到膜下室,细胞就会在化学趋化作用下向下移行穿过膜孔。如果是测试不溶性细胞外基质,则可将细胞外基质涂抹固定在膜的下侧,从而引导细胞穿过膜孔。
  2. 金颗粒试验:在这个试验中,金颗粒被涂抹固定在盖玻片上,其上涂抹细胞外基质,然后再加进细胞。当细胞移动时就会在金颗粒上留下它们移行的轨迹。
  3. 体外切割损伤/划横试验:试验开始时,用移液头在单层细胞上划横造出无细胞区,一定时间后划横周边细胞会移行进入划横处,从而也可用于细胞移行或移动性试验。此试验需用丝裂霉素C以避免细胞分裂对细胞移行测试的影响。

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