3H具有良好示踪作用

细胞在合成、分裂、增殖时需要摄取各种嘧啶核苷,氚标记脱氧嘧啶核苷酸 (3H-TdR)作为DNA补救合成的前体,可较特异地掺入细胞DNA中。因氚能放射出低能 β射线,半衰期长,生物毒性小,具有良好的示踪作用。故3H-TdR作为一种快速、简便、廉价的方法,广泛地用于内分泌基础研究领域中。3H-TdR体外标记法是根据目的选择需要标记的细胞,细胞数量级一般在105~107个/ml左右最佳,加入放有20%小牛血清或15%胎牛血清、RPMI-1640培养液的培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中培养,根据需要培养一段时间后加入3H-TdR,剂量也根据细胞多少而定,剂量过大有生物毒性,一般37kBq/ml较适宜。然后继续培养,培养时间根据需要而定,然后加入4℃冷盐水或其他试剂终止掺入,再用多头细胞收集器将细胞收集在红光49型玻璃纤维滤纸上,用培养液或生理盐水洗涤2~3遍,用50g/LTCA、无水乙醇脱水,脱色,烘干滤纸,置于闪烁液中测量(闪烁液一般用PPO,POPOP)。

Kanamaru等研究NO对体外骨原细胞MC3T3-E1增殖的影响。将不同浓度的NO供体S-亚硝基-N-乙酰-单-dl-青霉胺(SNAP)加入至96孔培养板,与MC3T3-E1细胞孵育72小时。在终止增殖前的15小时,每孔加入37kBq 3H-TdR。终止孵育后,细胞用蒸馏水洗涤3次,每孔加入100μl闪烁液,采用液体闪烁仪计数。

采用3H-TdR掺入法检测成骨细胞增殖,其操作步骤为:

  1. 在24孔细胞培养板各孔中加入0.25% Typsin-EDTA消化后的成骨细胞悬液1ml(加入的细胞数量为105个细胞/孔);
  2. 于37℃ CO2 培养箱中培养24小时;
  3. 给每孔加入37kBq 3H-TdR(溶于5μl Hanks液中),继续培养8小时;
  4. 弃细胞培养液,贴壁的成骨细胞用1ml预冷的10%TCA固定10分钟;
  5. 弃10% TCA后重新加入1ml预冷的10%TCA固定5分钟;
  6. 弃10%TCA固定液,每孔加入0.5ml细胞裂解液后置65℃烤箱20分钟裂解细胞;
  7. 把每孔的0.5ml细胞裂解液全部转移到液体闪烁计数管中,加入3ml闪烁液,混匀,在液闪仪上计数每分钟放射性计数值(cpm)。

3H-TdR掺入DNA反映细胞增殖状况

随着3H-TdR应用的深入,不少学者发现意外的结果。如果对该技术简单地、不加分析地应用,实验结果可靠性将受影响。比如3H-TdR储存过程中会出现辐射自分解,产生杂质,标记时要用新鲜的3H-TdR。核苷酸磷酸化酶存在胞质中,可降解3H-TdR,抑制3H-TdR掺入,所以要在掺入实验中注意核苷酸磷酸化酶的影响。此外,掺入DNA的放射性与DNA合成速度相关,但不一定成正比。3H-TdR掺入取决于细胞内外的TdR水平,而DNA合成速度不受影响。还有些影响DNA从头合成途径、抑制主动运输3H-TdR的药物,如MTX、烷化剂、Trenimon等,会增加或抑制3H-TdR的掺入,不影响DNA合成速度。3H-TdR掺入率还与培养基种类、培养时间、培养温度等有关。所以要做到实验条件的可比性。

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