放射配体标记可对受体分子进行定量和定位分析

放射受体分析或受体的放射配体结合分析是建立在放射性标记配体与受体之间的结合反应,它是目前对受体分子进行定量和定位分析研究的一项灵敏、可靠的技术。放射受体分析的原理与免疫放射测定相似。应用放射性核素标记配体,在一定条件下与相应受体结合成配体-受体复合物。由于两者的结合是表达配体与受体间的生物活性而非免疫活性,因此具有更高的特异性。放射受体分析可用于测定受体的亲和常数、解离常数、受体结合数以及定位分析等。

由于受体的配体大多数是肽类或小分子蛋白质,物理生化特性基本相似,所以核素标记方法也类似,主要是直接标记法和间接标记方法。直接法是通过氧化还原方法,把放射性核素直接嵌在配体上或替换其中某个元素。如,常用的氯胺T法碘标雌激素衍生物,就是把碘置于其16α位。近来有报道,通过改变蛋白质分子结构形成特殊环状结构可直接与某些放射性核素络合等,但标记条件要求较严,有的可能会改变配体的理化性质,在体内的稳定性报道也不一致。间接标记法主要是先通过耦联剂与配基结合,再与放射性核素络合,可用的双功能耦联剂(BCA)有DTPA、MDTPA、Bz-DTPA、EMCS-Bz-EDTA、SCN-Bz-EDTA等,近来有些放射性锝标记肽类的报道,但方法较复杂。

用于放射配体标记的物质有多种选择

雌激素标记

人们对雌激素的研究较多,现有数十种雌激素的衍生物用于放射性标记研究,常用的放射性核素有18F、123I、77Br、99mTc及186Re等。通过各种方法标记类固醇激素的不同部位,但不同部位对配体特性影响不同,研究表明氟或碘标记于雌二醇或己雌醇的16α位,对雌激素与其受体结合的特性影响最小。由于放射性锝(99mTc)是核医学中最常用的核素,许多研究者试图用99mTc标记类固醇激素,但99mTc标记涉及螯合系统,结构较大,易改变配体的立体结构,影响配基与配体结合的亲和力。有学者研究报道,在甾体的C-环近11β位、D-环下方16及17碳后面进行取代基团,对配基与受体结合的特性影响较小。

亲和素标记

范等分别用131I和188Re标记亲和素,测定其与生物素结合的能力,并与未标记的亲和素、罗丹明标记的亲和素进行比较,测定标记亲和素与生物素结合曲线和半解吸量。结果表明,放射性标记的亲和素与生物素结合的能力低于未放射性标记的亲和素和罗丹明标记的亲和素。将表达克隆的人胰高血糖素受体的中国仓鼠卵巢细胞(CHO-hGCGR)膜2mg,分别与50pmol/L的125I标记的胰高血糖素和1μmol/L未标记的胰高血糖素在缓冲液(含50mmol/ LTris-HCl、5mmol/L MgCl2、2mmol/L EDTA、12%甘油,pH7.5)中室温孵育4~12小时,分别检测受体特异性和非特异性结合。发现复合物Cpd 1 能抑制125I标记的胰高血糖素与人胰高血糖素受体结合,提示Cpd 1可阻断胰高血糖素介导的肝糖原分解作用。而相应的类似物Cpd 2却无此阻断效应。

采用孕酮治疗非妊娠的卵巢切除后鼠,收集其肠系膜动脉,在50mmol/L Tris-羟甲基氨基甲烷缓冲液中制成匀浆液,并离心分离膜制备物。将1份100μg蛋白/管制备物1份与8.3×10-12mol/L 125I标记人降钙素基因相关蛋白(总体积300μl)在4℃下孵育150分钟;另1份除上述条件外,尚加入32×10-15~13×10-9mol/L系列浓度未标记的人降钙素基因相关蛋白(CGRP)。特异性结合用标记的CGRP结合数减去未标记CGRP与膜蛋白结合数,通过采用Scatchard模式分析后,表达成CGRP与膜蛋白结合率。发现孕酮或孕酮结合E2治疗能增加鼠CGRP-B-受体蛋白水平。

促甲状腺素受体抗体(TRAb)标记

TRAb是自身免疫性甲状腺疾病患者体内产生的一种自身抗体,包括TSAb 和TSBAb,可与TSHR分子上不同位点作用产生不同的生物学效应。目前较为成熟的TRAb检测技术为放射受体分析法(RRA)。该方法是依据TRAb可以抑制促甲状腺素(TSH)与其受体结合的原理设计的TRAb检测的传统方法,即将患者待测IgG、125I标记的牛TSH与TSHR一起温育,终止反应后测定标记TSH结合率,并以正常血清IgG作对照,观察患者血清IgG对125I标记的TSH与其受体结合的抑制活性。该方法检测的TRAb又称TSH结合抑制免疫球蛋白(TBII),故RRA也称TBII法。

常规TBII法利用PEG对抗原/核素标记物的复合物进行沉淀、离心,从而与游离的核素标记物相分离,故能较精确地反映患者血清IgG对125I标记TSH与其受体结合的抑制活性。近年来发现,PEG等非离子亲水多聚物可提高检测灵敏度。若在采用猪TSHR的TBII检测中较早加入浓度较高的PEG可提高该方法的检测灵敏度。由于TRAb具有种属特异性,人TSHR应是检测的最佳选择,但人甲状腺组织不能稳定供用,故一直将来源充足、性质稳定的猪TSHR作为人TSHR的较好替代物,但有10%甚至更多的GD甲亢确诊患者应用该TBII法检测为假阴性。因此,研究者们一直在努力,希望以重组的人TSHR取代猪TSHR,以提高检测灵敏度。高度表达重组的人类全长TSHR的白血病细胞系k562可提供大量优质受体蛋白,应用于TBII的实际检测。该检测方法简称为重组TBII法,并已有试剂盒供应,灵敏度和特异性均较理想。

在病因学研究方面,用TRAb标记技术证明,TRAb,尤其是TSH受体的刺激性抗体(TSH receptor stimulating antibody,TSAb)参与了Graves眼病的发病过程。

(黄干)

系统的医学参考与学习网站:天山医学院, 引用注明出处:https://www.tsu.tw/edu/3400.html