稀土元素标记物的制备

采用稀土元素标记抗原或抗体已广泛应用于内分泌激素以及自身抗体的检测,是目前最灵敏的微量分析技术之一。平时常用的稀土金属主要是Eu(铕)、Sm(钐)和Tb(铽),Eu荧光寿命1毫秒,在水中不稳定,但加入增强剂后可以克服;Tb荧光寿命1.6毫秒,水中稳定,但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解,因此从测量方法学上看Tb很好,但不适合用于生物分析,故Eu最为常用。

(一) 稀土离子需用螯合剂将其和抗体或抗原分子的氨基连接

常用的螯合剂有:①多羧基酸类螯合剂:异硫氰酸苯基-EDTA,异硫氰酸苯基-DTTA和二乙烯-三胺-五乙酸(DPTA)及其环酐(CDPTA)等;②β二酮体类螯合剂:常用2-萘酰三氟丙酮(2-NTA)作为DELFM系统荧光增强液的主要成分。W1174及(4,7)-双(氯化苯酚磺酸盐)-1,10菲洛林(简称BCPDA),是CyberFluor分析系统的主要螯合剂。

(二) 标记抗体和抗原各有优缺点

抗体标记分为螯合剂先螯合Eu3+,再连接蛋白质(一步法);和先连接蛋白质,再螯合Eu3+(二步法)。如标记第二抗体或亲和素,可作为通用试剂,并具有放大作用,有利于提高方法的灵敏度。完全抗原的标记方法与抗体相同。小分子半抗原则需先与大分子载体蛋白,如BSA、多聚赖氨酸等连接,再标记Eu3+

(三) 稀土元素标记有诸多商品化试剂盒供应

采用Eu和Sm(钐)分别标记TSH和T4,建立了一步法同时检测血清TSH和T4的时间分辨免疫荧光法,发现TSH的最低检测限为0.028mIU/L,T4为4.1nmol/L。线性范围TSH 为0.21~80.00mIU/L,T4为20~300nmol/L。

将0.5mg抗C肽单克隆抗体加入Millipore公司带有滤膜的离心管中,8000r/min离心5~6分钟;再加入标记缓冲液(50mmol/L,Na2CO3,pH9.0)200μl,8000r/min离心5~6分钟,重复此洗涤步骤6次;反转离心柱,2000~3000r/min离心1分钟,收集滤液,此即浓缩和纯化好的标记抗体,然后加入0.05mg铕标记试剂充分混匀,25℃振荡过夜。标记完成后用Sephadex G-50层析柱(1cm×30cm)分离纯化,洗脱液(50mmol/LTris HCl,9g/L NaCl)洗脱,收集流出液(1ml/管),逐管测量吸光度(A280nm),合并峰管,定出蛋白含量,同时以PerkinElmer公司Eu3+标记试剂盒中的Eu3+标准测定合并峰管的Eu3+浓度。所得标记率(Eu3+ mol/IgG mol)是10.97,蛋白回收率为90%。由此建立的人C肽时间分辨免疫荧光分析法可测范围为0.5~22ng/ml,灵敏度为0.045ng/ml,批内、批间的变异系数(CV)分别为4.1%~6.7%和5.4%~6.8%;与胰岛素无交叉反应,与胰岛素原的交叉反应率为9.0%。

20世纪90年代,随着生物素-亲和素系统(BAS)引入TrFIA,建立了一种新型的BAS-TrFIA方法,该法主要是抗原抗体的生物素化,然后用Eu3+-链亲和素(Eu3+-SA)作为示踪物,待反应体系完成后进行时间分辨荧光检测。SA稳定性好,有较强的耐热性,在免疫测定中的非特异性结合又低,是很好的Eu3+标记物前体。该技术目前已十分成熟,应用范围也日益扩展,已广泛用于各种激素类物质、肿瘤标志物等物质的检测。Ankelo 和Westerlund-Karlsson 等采用Eu标记抗体分别建立了谷氨酸脱羧酶抗体(GAD-Ab)和蛋白酪氨酸磷酸酶-2抗体(IA-2A)的时间分辨免疫荧光检测法,其中GAD-Ab检测法是采用链霉亲和素包被微孔平板,然后加入生物素标记的GAD65孵育后,加入血清标本与质控物,孵育,加入Eu标记的GAD65。洗涤后,用荧光仪检测延迟荧光。而IA-2A检测法是将IA-2的胞内部分(IA-2ic)生物素化,然后与血清标本、谷胱甘肽S-转移因子(GST)-IA-2ic融合蛋白加入到链霉亲和素包被微孔平板中共同孵育,被血清中IA-2A捕获的GST-IA-2ic为Eu标记的抗-GST抗体所结合,最终用时间分辨荧光仪检测荧光信号。

Ankelo等报道,时间分辨免疫荧光法检测GAD-Ab的检测限为1.49U/ml,标准曲线线性达4140 WHOU/ml,在41400 WHO U/ml内无HOOK效应。批内CV为5.4%~7.0%,批间CV 为9.8%~13%。回收率为86%~104%,与抗甲状腺过氧化物酶抗体(TPO-Ab)交叉反应小,与抗甲状腺球蛋白抗体(Tg-Ab)无交叉反应。溶血血清(0.5~10g/L)和脂血血清(0.25~10g/L)对检测结果无影响。Westerlund-Karlsson等报道,时间分辨免疫荧光法检测IA-2A的检测限为0.5μg/L,线性达1400μg/L。在5000μg/L范围内无HOOK效应。批内CV 为6.8%~20%,批间CV为14%~21%。回收率为83%~118%,溶血血清(0~5g/L)、黄疸血清(胆红素0~180g/L)以及脂血血清(0~4.5g/L)对检测结果无影响。

Palomer等对时间分辨免疫荧光法检测IA~2A与标准的放射配体法进行了比较,发现两者诊断特异性分别为99%和97%(74例健康人),对56例新发的T1DM诊断灵敏度分别为:时间分辨免疫荧光法37%,放射配体法50%。

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