荧光是核酸探针中很重要的一种标记物,荧光标记的核酸分子探针(probe)用于检测核酸样品中特定的核苷酸序列。核酸探针可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针及人工合成的寡核苷酸探针。常用的荧光标记试剂有FITC、TAMTA、吲哚二羧菁(Cy3、Cy5)及SYBR GreenⅠ等。

荧光标记核酸分为直接标记和间接标记

直接标记是通过荧光素直接与探针核苷或磷酸戊糖骨架共价结合,杂交后直接检测荧光信号。例如在核苷酸5′或3′端引入一个带长链的氨基臂或巯基臂,活性的氨基或巯基可直接与荧光试剂相结合。

间接标记是指将生物素连接在探针上,利用亲和素对生物素有极高亲和力的原理,杂交后用耦联荧光试剂的亲和素检测。一般分为酶学标记法和化学标记法两种。

生物素与连接臂结合后,再与dUTP结合,形成Bio-ndUTP(n为连接臂的碳链长度)。通过末端转移酶将生物素底物直接连于核苷酸的3′羧基末端,再用荧光试剂D亲和素检测。酶学法有灵敏度高的优点,但其修饰过程复杂、成本高,难于大规模制备。化学法以寡核苷酸为例,寡核苷酸5′端磷酸化后,与1,2-二氨基己烷反应,加上氨基基团与N-羟基琥珀酰亚胺基-生物素(NHS-生物素)作用,将生物素标于寡核苷酸的5′端,再进行荧光试剂-亲和素检测。化学法具有方法简单、成本低、标记方法较通用等优点。同蛋白一样,核酸标记后需纯化,分离游离荧光试剂和未标记的探针。可用葡聚糖凝胶柱去除荧光试剂,分离未标记的探针可用反相HPLC、PAGE电泳等。

荧光标记核酸技术发展迅速

随着核酸探针技术的发展,相应也带动了荧光原位杂交、荧光斑点杂交、基因芯片及Southern印迹杂交等技术的发展。荧光标记核酸探针正逐步代替放射性核素探针在这些技术中很好地得以应用。

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