核糖核酸RNA分析方法

Norffiern印迹杂交

Northern印迹杂交(Northern blot)是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。这种方法可检测皮肤细胞或组织中的RNA及其含量。Northern印迹杂交基本方法是用乙二醛或甲醛使RNA变性,用琼脂糖凝胶电泳分离RNA,高盐下通过毛吸作用将RNA从凝胶中转印至硝酸纤维素滤膜上,烘干固定后即可用于杂交。凝胶中RNA片段的相对位置在RNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着。附着在滤膜上的RNA与32p标记的探针杂交,利用放射自显影术确定探针互补的每条RNA带的位置,从而可以确定某一特定序列的RNA片段的位置和大小。

核糖核酸酶保护分析(ribonuclease protection assay,RPA)

RPA是一种敏感性高于Northern印迹杂交的mRNA定量检测技术。利用32P(放射法)或生物素(非放射法)标记由多个目标基因的DNA模板体外转录出的长短不一的RNA探针,将含过量探针的溶液与样品总RNA杂交,经核糖核酸酶(RNase)处理后,未与探针杂交的单链RNA和过量的游离探针被降解,而目标RNA则因与探针结合形成双链而被“保护”,则杂交双链RNA的量代表了样本中相应基因的表达量。

原位杂交技术

原位杂交(in situ hybridization),属于固相分子杂交,它是用标记的DNA或RNA为探针,在原位检测组织细胞内特定核酸序列,用同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交,杂交后分别通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法一般用半抗原标记探针,最后通过免疫组织化学法对半抗原定位,间接地显示探针与靶核酸形成的杂交体。原位杂交用于研究基因定位以及信使mRNA表达程度。

反转录-聚合酶链反应(reverse-transcription( RT) -PCR)

RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶作用从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR技术可用于对基因表达信息进行检测或定量,检测细胞中基因表达水平、RNA病毒含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。另外,这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术更灵敏、更易于操作。

逆转录反应可以使用逆转录酶,以随机引物、oligo (dT)或基因特异性的引物(GSP)起始。逆转录酶(reverse transcriptase)是一种存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶,至少具有以下三种活性:

  1. 依赖RNA的DNA聚合酶活性:以RNA为模板合成cDNA第一条链;
  2. Rnase水解活性:水解RNA杂合体中的RNA;
  3. 依赖DNA的DNA聚合酶活性:以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA。

作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA,关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、OligodT及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可。

RT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中,每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在反转录缓冲液中进行,然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中,反转录和PCR在同时为反转录和PCR优化的条件下,在一只管中顺次进行。

RNA干扰(RNAi)技术

外源和内源性双链RNA(dsRNA)在细胞内诱导同源序列的基因表达受抑的现象称为RNA干扰。RNA干扰的具体机制和过程还不完全清楚,RNA干扰过程可概括如下:

  1. dsRNA的处理,dsRNA经过一种核酸酶Ⅲ类似的RNA内切酶dicer作用,把dsRNA链酶切成长约21-25nt的dsRNA链。这种RNA分子称为小干扰RNA( siRNA)。
  2. siRNA形成之后,与一系列特异性蛋白结合形成siRNA诱导干扰复合体(siRNA induced interference complex,RISC)。在RISC作用下,siRNA双链解开,其负链与靶mRNA互补结合。进而RISC在互补区切断靶mRNA。被切割后的断裂mRNA随即降解,从而使该基因的表达受抑,这就是转录后的基因沉默(posttranscription gene silencing,PTGS)。

RNAi技术大量用于抑制基因的表达(沉默基因),从而研究基因的功能。在进行RNAi实验时,首先检索特定基因的序列,避免靶向部位是非编码区和基因间隔区;然后设计siRNA序列,siRNA序列可通过化学合成,使用质粒或病毒载体(腺病毒、腺相关病毒、慢病毒)转染到细胞或动物体内抑制基因的表达。

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